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實現(xiàn)高通量解析SARS-CoV-2刺突蛋白與不同抗體結(jié)合的表位結(jié)構(gòu)
針對SARS-CoV-2刺突蛋白的治療性抗體可保護(hù)脆弱人群遠(yuǎn)離嚴(yán)重或具有潛在威脅的疾病，這在幫助緩解當(dāng)前肺炎疫情大流行中發(fā)揮著重要作用。冷凍電子顯微鏡（cryo-EM）是一種強(qiáng)大的儀器，可用于繪制阻斷SARS-CoV-2病毒入侵的抗體表位圖[1]。通過解析SARS-CoV-2和抗體結(jié)合的表位，可以使我們能夠了解它們之間的作用機(jī)制，并增加我們對抗體如何賦予保護(hù)性免疫力的認(rèn)知。此外，對抗體表位和作用機(jī)制的精確了解，也可以指導(dǎo)抗體療法的改進(jìn)，生產(chǎn)新的抗體治療藥物。例如，冷凍電鏡解析了刺突蛋白和不同抗體的非重疊結(jié)合表位，從而促進(jìn)了 “抗體雞尾酒" 療法的研發(fā)，降低了病毒逃逸的風(fēng)險[2]。
目前， 肺炎疫情大流行的主要原因之一是SARS-CoV-2 不斷變異，新變異毒株可能逃避免疫。其中一個便是Omicron（B.1.1529）變異株，在其與受體結(jié)合區(qū)域 (receptor-binding domain) ，含有迄今為止最多的突變位數(shù)量。刺突蛋白和抗體結(jié)合的表位結(jié)構(gòu)，能快速識別刺突蛋白脆弱位點，并預(yù)測和解釋新突變可能帶來的影響，還能加快針對非重疊結(jié)合表位的抗體組合決策選擇效率。此外，關(guān)于表位的結(jié)構(gòu)信息，可以幫助確定新的藥物研發(fā)管線，以應(yīng)對新出現(xiàn)的變體。因此，如何使用冷凍電鏡加速抗原抗體表位篩選成為我們所考慮的問題之一。
在這里，我們將探討如何通過 Thermo Scientific™ EPU 軟件 的EPU Multigrid收集功能將 cryo-EM 用于高通量表位作圖。在本研究中，我們從 12 種臨床前階段抗體中，生成并表征了一組針對受體結(jié)合域的特異性SARS-CoV-2中和抗體。這組抗體代表了一系列 SARS-CoV-2 抗體的中和效力、親和力及其余六種粗表位庫。這六種抗體表位庫中，大部分抗體來自 肺炎 患者，另一些來自人抗IgG 動物的免疫接種。在此， 我們展示了如何從為期 2 天的無人值守冷凍電鏡中，在12 個含有不同 Fab 的spike-Fab復(fù)合物的載網(wǎng)上獲得12個優(yōu)于3 ?的刺突蛋白結(jié)構(gòu)（圖 1）。
圖1. 使用EPU Multigrid在200kV Glacios Cryo-TEM上實現(xiàn)的SARS-CoV-2刺突蛋白抗體的高通量冷凍電鏡表位圖。
我們使用Glacios Cryo-TEM和Falcon 4直接電子檢測相機(jī)對SARS-CoV-2刺突蛋白進(jìn)行單顆粒分析。在此實驗中，在1.5小時內(nèi)收集了28,162個顆粒，并計算重構(gòu)了一個3.1埃的刺突蛋白膜外區(qū)結(jié)構(gòu)（圖2）。
圖2. 使用Glacios Cryo-TEM和Falcon 4直接電子檢測相機(jī)對SARS-CoV-2刺突蛋白進(jìn)行單顆粒分析。右圖，代表包含搭建原子結(jié)構(gòu)的密度圖（PDB ID：6XR8）。
EPU Atlas Screening用于收集總共24個載網(wǎng)的圖像，并從中選出12個最佳的載網(wǎng)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。EPU Multigrid可以通過使用 "Max Exposures "選項限制每個載網(wǎng)拍攝的圖像數(shù)量來進(jìn)行篩選工作。為了衡量我們的12個載網(wǎng)是否具有解析高分辨結(jié)構(gòu)的質(zhì)量，我們在Glacios Cryo-TEM上使用EPU Multigrid，為每個spike-Fab復(fù)合物收集50張圖像。將這些小數(shù)據(jù)集在cryoSPARC Live軟件中進(jìn)行預(yù)處理[3]。在獲得良好的預(yù)處理結(jié)構(gòu)后，我們繼續(xù)對12個經(jīng)過篩選的載網(wǎng)使用Thermo Scientific Krios™ G4 Cryo-TEM進(jìn)行無人值守EPU Multigrid數(shù)據(jù)收集（其中Krios™ G4配備了E-CFEG冷場電子槍、Thermo Scientific Selectris™ X能量過濾器和Thermo Scientific Falcon 4直接電子檢測相機(jī)）。我們將EPU Multigrid設(shè)置為每個載網(wǎng)收集1,000張圖像，實現(xiàn)了每小時250張圖像的速度。數(shù)據(jù)采集參數(shù)請見表1。
表1.冷凍電鏡數(shù)據(jù)收集參數(shù)
使用4塊GPU的工作站進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，每個數(shù)據(jù)集處理耗時約12小時，計算結(jié)構(gòu)顯示12個spike-Fab復(fù)合物的分辨率都優(yōu)于3 ?（見表2）。
表2. 不同spike-Fab復(fù)合物的整體和局部分辨率。
使用cryoSPARC軟件對Krios G4 Cryo-TEM收集的數(shù)據(jù)進(jìn)行3埃內(nèi)的結(jié)構(gòu)重建。在漂移校正和CTF校正后，使用blob picker挑選顆粒，4x binning提取顆粒，并進(jìn)行二維分類。本研究中的Fabs來自臨床前開發(fā)階段的抗體，其特征在于SARS-CoV-2和變異假病毒的中和等特征。在此，我們突出顯示了來自12個Spike-RBD中S2和RBD的密度，以代表整體分辨率和局部分辨率（圖3）。
圖3. 本研究中的12個spike-Fab復(fù)合物的S2和RBD的代表性密度。S2通常是刺突蛋白中分辨率最高的部分。因此，S2的密度代表了整體分辨率。相反，RBD-Fab區(qū)域是多變的，通常分辨率很低。在這項研究中。對RBD-Fab區(qū)域進(jìn)行了local refinement，以提高表位的局部分辨率。因此，RBD密度代表了與表位相鄰區(qū)域的局部分辨率。
冷凍電鏡更快速的數(shù)據(jù)收集與EPU Multgrid功能的實現(xiàn)，促進(jìn)了基于片段的藥物發(fā)現(xiàn)和抗原抗體結(jié)合表位的高通量篩選[4]。
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References
1. C. O. Barnes et al., SARS-CoV-2 neutralizing antibody structures inform therapeutic strategies, Nature, vol. 588, no. 7839, pp. 682–687, Dec. 2020.
2. J. Hansen et al., Studies in humanized mice and convalescent humans yield a SARS-CoV-2 antibody cocktail, Science (New York, N.Y.), vol. 369, no. 6506, pp. 1010–1014, Aug. 2020.
3. A. Punjani, J. L. Rubinstein, D. J. Fleet, and M. A. Brubaker, cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination, Nature Methods, vol. 14, no. 3,
pp. 290–296, 2017.
4. M. Saur et al., “Fragment-based drug discovery using cryo-EM," Drug Discovery Today, vol. 25, no. 3, pp. 485–490, 2020.