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NAD激酶（NADK）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)
可見(jiàn)分光光度法
注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng)，請(qǐng)注意并嚴(yán)格按照該說(shuō)明書(shū)操作。
貨號(hào)：BC1030
規(guī)格：50T/24S
產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑三：用時(shí)加入3.75mL雙蒸水，充分溶解，可分裝保存，-20℃保存兩周，禁止反復(fù)凍融；臨用前取出一支稀釋100倍使用。

2. 試劑四：用時(shí)加入2.5 mL雙蒸水，充分溶解，2-8℃保存；

3. 試劑五：用時(shí)每瓶加入3 mL雙蒸水，充分溶解，2-8℃保存；

4. 試劑六：用時(shí)加入6 mL雙蒸水，充分溶解，2-8℃保存；

5. 試劑七：用時(shí)加入6 mL雙蒸水，充分溶解，2-8℃避光保存；

6. 試劑八：液體置于試劑瓶?jī)?nèi)EP管中。臨用前加入3 mL蒸餾水充分溶解，可分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

7. 試劑十：自備95%乙醇；

8. 標(biāo)準(zhǔn)品：加入1.9 mL蒸餾水，即得2 μmol/mL NADP標(biāo)品。臨用前稀釋100倍得20 nmol/mL NADP標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

產(chǎn)品說(shuō)明：
NADK（EC 2.7.1.23）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是目前所發(fā)現(xiàn)的生物體內(nèi)能夠催化NAD⁺磷酸化生成NADP⁺的酶，可催化NAD(H)以ATP或無(wú)機(jī)*[poly(P)]作為磷酰基供體進(jìn)行磷酸化反應(yīng)，生成NADP(H)。因此，NAD激酶在合成NADP(H)以及調(diào)節(jié)NAD(H)與NADP(H)的平衡上具有重要作用。


NADK催化NAD⁺磷酸化，生成NADP⁺；NADP⁺可被6-磷酸葡萄糖脫氫酶還原為NADPH；NADPH通過(guò)PMS的遞氫作用，還原氧化型噻唑藍(lán)（MTT），通過(guò)其在570nm的吸光值大小可反映出NADK活性的大小。
注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。
需自備的儀器和用品：
臺(tái)式離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)、水浴鍋、1mL玻璃比色皿、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、無(wú)水乙醇、冰和蒸餾水。
操作步驟：具體操作步驟詳見(jiàn)“產(chǎn)品資料"附件

注意事項(xiàng)：

1. 樣本的處理必須在0℃-4℃中操作完成，以防止酶變性失活。建議在正式實(shí)驗(yàn)前，選取差別較大的兩個(gè)樣本進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。

2、試劑三、四、五、六、七、八在測(cè)定過(guò)程中都必須在冰上放置。
3、當(dāng)初始吸光值大于0.6時(shí)，建議將樣本用PBS稀釋后測(cè)量。
4、若測(cè)量樣本數(shù)量過(guò)多，可以將試劑二、五、六、七按比例配成工作液使用。
實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 取0.1大鼠腎臟加入1mL提取液進(jìn)行勻漿研磨，取上清稀釋2倍后按照測(cè)定步驟操作，測(cè)得A測(cè)定=0.455，A對(duì)照=0.213，計(jì)算ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照=0.455-0.213=0.242，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.1662x-0.0343，計(jì)算x=（0.242+0.0343）/0.1662=1.66，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

NADK（U/g 質(zhì)量）=0.067×x÷W×稀釋倍數(shù)=0.067×1.66÷0.1×2=2.22 U/g 質(zhì)量。

1. 取小鼠血漿直接檢測(cè)，測(cè)得A測(cè)定=0.131，A對(duì)照=0.094，計(jì)算ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照=0.131-0.094=0.037，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.1662x-0.0343，計(jì)算x=（0.037+0.0343）/0.1662=0.429，按血漿體積計(jì)算酶活得：

NADK（U/mL）=0.067×x =0.067×0.429=0.028 U/mL。
參考文獻(xiàn)：

1. Pollak N, Niere M, Ziegler M. NAD kinase levels control the NADPH concentration in human cells[J]. Journal of Biological Chemistry, 2007, 282(46): 33562-33571.

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