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          讓長(zhǎng)讀取來(lái)拯救基因組組裝

          閱讀:1389      發(fā)布時(shí)間:2013-5-9
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          新一代測(cè)序的出現(xiàn),讓科學(xué)家們能夠更快地實(shí)現(xiàn)基因組測(cè)序,且成本比Sanger測(cè)序要低得多。但是,這是以犧牲讀長(zhǎng)為代價(jià)的,平均讀長(zhǎng)從Sanger測(cè)序時(shí)的800-900 bp降低如今的100 bp左右。短的讀長(zhǎng)讓基因組組裝更加困難,因?yàn)樾枰疃雀采w才能產(chǎn)生相當(dāng)?shù)慕M裝。為了解決這一問(wèn)題,Worley及其同事近轉(zhuǎn)向了Pacific Biosciences公司的PacBio RS平臺(tái)。
          然而,有些問(wèn)題是更深度覆蓋也無(wú)法彌補(bǔ)的。對(duì)于de novo組裝,長(zhǎng)度超過(guò)讀長(zhǎng)的重復(fù)序列會(huì)產(chǎn)生缺口,導(dǎo)致近年來(lái)更多片段化的組裝。因此,我們很難檢測(cè)重復(fù)區(qū)域的變異,而這些對(duì)了解某些疾病可能很重要。
          對(duì)此,貝勒醫(yī)學(xué)院人類基因組測(cè)序中心的遺傳學(xué)家Kim Worley談道:“令人沮喪的事情是100 bp讀取中沒(méi)有太多的信息內(nèi)容。”她指出,在恒河猴的基因組草圖中,高達(dá)20%的基因模型都含有缺口。
          Worley表示:“我們已經(jīng)完成了人類基因組和小鼠基因組,而其他一切都仍未完成。即使是已經(jīng)完成的基因組,也有并不*連續(xù)和正確的區(qū)域,而用戶對(duì)那些區(qū)域的數(shù)據(jù)總是不滿意。”
          為了解決這一問(wèn)題,Worley及其同事近轉(zhuǎn)向了Pacific Biosciences公司的PacBio RS平臺(tái)。這是一種第三代測(cè)序技術(shù),能夠?qū)崟r(shí)開展單分子測(cè)序反應(yīng)。該系統(tǒng)的平均讀長(zhǎng)在幾kb,而某些情況下的大讀長(zhǎng)能達(dá)到30 kb。
          這些長(zhǎng)的序列讀取簡(jiǎn)化了基因組組裝,因?yàn)樗鼈兡軌蚩缭街貜?fù)區(qū)域,而且不需要DNA的擴(kuò)增,從而減少了某些測(cè)序假象和基因組覆蓋偏向。因此,PacBio RS平臺(tái)產(chǎn)生的長(zhǎng)讀取無(wú)GC偏向或系統(tǒng)誤差,適用于基因組組裝的升級(jí)。
          正如去年在《PLoS ONE》上介紹的,Worley及其同事開發(fā)出一種自動(dòng)的軟件工具,名為PBJelly。1 它能夠?qū)?/span>PacBio長(zhǎng)讀取與組裝草圖比對(duì),關(guān)閉或改善缺口,同時(shí)保留注釋。研究人員將這種方法應(yīng)用在四個(gè)基因組上,解決了63%-99%的缺口,能關(guān)閉32%-69%并改善12%-63%。
          PacBio的科學(xué)官Jonas Korlach表示:“我們正在經(jīng)歷一場(chǎng)復(fù)興,一場(chǎng)已完成基因組的復(fù)興。在Sanger測(cè)序的年代,這是慣例,但是當(dāng)新一代技術(shù)到來(lái)時(shí),它幾乎被拋棄,因?yàn)閹缀醪豢赡芡ㄟ^(guò)Sanger測(cè)序來(lái)結(jié)束那些基因組。”
          從原理上說(shuō),PBJelly適用于任何平臺(tái)所產(chǎn)生的長(zhǎng)序列讀取。不久之后,當(dāng)新一代測(cè)序公司趕上PacBio的讀長(zhǎng)時(shí),這一特征就顯得尤為重要。
          正在朝這一方向努力的是Illumina公司。不久前,它收購(gòu)了Moleculo公司,該公司開發(fā)的技術(shù)讓大的DNA片段可在Illumina標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序系統(tǒng)上進(jìn)行測(cè)序,隨后組裝成合成的長(zhǎng)讀取。來(lái)自每個(gè)分子的短序列讀取分別組裝,終結(jié)果是所有片段的完整序列。從本質(zhì)上講,短讀取數(shù)據(jù)重建成長(zhǎng)讀取。
          1月份召開的動(dòng)植物基因組大會(huì)上,一組科學(xué)家報(bào)告稱,Moleculo技術(shù)可利用Illumina HiSeq2000平臺(tái),產(chǎn)生長(zhǎng)度跨越1.5-15 kb的準(zhǔn)確DNA測(cè)序讀取。
          另一個(gè)長(zhǎng)讀取技術(shù)的范例是454GS FLX+系統(tǒng),它帶來(lái)了長(zhǎng)度達(dá)1000 bp的讀取。眼下,一個(gè)研究協(xié)作組正在利用這種測(cè)序技術(shù)來(lái)分析和組裝RP11人類參考基因組,試圖關(guān)閉缺口并發(fā)現(xiàn)基因組序列中的新基因。
          454生命科學(xué)研發(fā)部門的副總裁Todd Arnold表示:“454一直以高質(zhì)量、長(zhǎng)讀取而著稱。”隨著讀長(zhǎng)和通量逐步上升,“我們?cè)谠黾幼x長(zhǎng)時(shí)也力爭(zhēng)保留我們的質(zhì)量值,因?yàn)檫@對(duì)我們的客戶非常重要。”
          但根據(jù)Korlach的說(shuō)法,現(xiàn)有的其他技術(shù)都無(wú)法與PacBio抗衡。他表示,目前存在根本的技術(shù)差異和限制,使得其他技術(shù)無(wú)法提供PacBio的連續(xù)讀長(zhǎng)。
          不過(guò),PacBio長(zhǎng)讀取技術(shù)也有缺點(diǎn),那就是錯(cuò)誤率高。盡管通過(guò)環(huán)化測(cè)序可實(shí)現(xiàn)高度準(zhǔn)確的測(cè)序結(jié)果,但PacBio RS儀器產(chǎn)生的單向讀取,平均準(zhǔn)確性只有87-89%。該公司負(fù)責(zé)產(chǎn)品管理的總監(jiān)Edwin Hauw表示:“我們正在努力改善這一點(diǎn),但準(zhǔn)確性仍將在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)低于其他現(xiàn)有技術(shù),因?yàn)槲覀兊募夹g(shù)是基于單分子的實(shí)時(shí)檢測(cè)。”
          東京大學(xué)的計(jì)算生物學(xué)家Michiaki Hamada對(duì)那些錯(cuò)誤率不以為然。“在我看來(lái),這些高錯(cuò)誤率不會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的問(wèn)題,因?yàn)榇蟛糠皱e(cuò)誤可通過(guò)低錯(cuò)誤率的短讀取來(lái)校正,比如Illumina測(cè)序儀所產(chǎn)生的那些。”
          在近的一項(xiàng)研究中,Hamada及他的團(tuán)隊(duì)開發(fā)出一種名為PBSIM的讀取模擬器,它捕獲了PacBio讀取的主要特征。Hamada表示,他們的長(zhǎng)期目標(biāo)是開發(fā)出適用于長(zhǎng)讀取的de novo組裝程序,但目前還沒(méi)有模擬器能針對(duì)PacBio文庫(kù)的生成。
          Hamada及其同事利用PBSIM來(lái)分析13個(gè)PacBio數(shù)據(jù)集,結(jié)果發(fā)表在《Bioinformatics》上。2 在開展PacBio讀取的混合糾錯(cuò)和組裝檢測(cè)之后,他們發(fā)現(xiàn),通過(guò)覆蓋深度少為15的連續(xù)長(zhǎng)讀取,再加上覆蓋深度少為30的循環(huán)測(cè)序,可獲得大量的組裝結(jié)果。Hamada表示:“PBSIM不僅可用于組裝程序的評(píng)估,可能用于測(cè)序的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。”
          由于參考基因組中的缺口可能包含了與疾病相關(guān)的基因,故長(zhǎng)讀取技術(shù)的利用對(duì)臨床領(lǐng)域有重大影響。例如,Arnold及其同事鑒定出一個(gè)可能參與癌癥發(fā)展的區(qū)域。“有證據(jù)表明該基因來(lái)自早期的RNA序列數(shù)據(jù),但它并未出現(xiàn)在參考基因組中,因此開展重測(cè)序研究的人員看不到。參考文庫(kù)越完整,你以積極方式使用這些數(shù)據(jù)的能力就越強(qiáng)。”

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