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          技術文章

          大鼠TRF ELISA KiT

          閱讀:811          發(fā)布時間:2010-1-20

          產(chǎn)品編號: EIA06229
          使用前*閱讀說明書。本酶聯(lián)免疫試劑盒是基于經(jīng)典酶聯(lián)夾心技術原理,能測量大鼠TRF,只能用于研究用途,不得用于醫(yī)學診斷。

          工作原理
          TRF,轉鐵蛋白(transferrin)。轉鐵蛋白是血漿中主要的含鐵蛋白質,負責運載由消化管吸收的鐵和由紅細胞降解釋放的鐵。以TRF-Fe3+的復合物形式進入骨髓中,供成熟紅細胞的生成。TRF分子量約7.7萬,為單鏈糖蛋白,含糖量約6%。TRF可逆地結合多價離子,包括鐵、銅、鋅、鈷等。每一分子TRF可結合兩個三價鐵原子。TRF主要由肝細胞合成,半壽期為7天。血漿中TRF的濃度受鐵供應的調節(jié),在缺鐵狀態(tài)時,血漿TRF濃度上升,經(jīng)鐵有效治療后恢復到正常水平。所提供的ELISA Kit是典型的夾心法酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(ELISA)。預先包被的抗體為多克隆抗體。檢測相抗體也為多克隆抗體,經(jīng)生物素(biotin)標記。樣品和生物素標記抗體先后加入酶標板孔反應后,PBS或TBS洗滌。隨后加入過氧化物酶標記的親和素反應;經(jīng)過PBS或TBS的*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的待測因子呈正相關。

          每套試劑盒中內容(96T)

          材料 數(shù)量
          標準品 重組凍干品×2
          預包被抗體的96孔板 1板(8×12)
          生物素標記抗體 0.12ml(1:100)
          ABC(親和素-過氧化物酶復合物) 0.12ml(1:100)
          樣品稀釋液 15ml×2
          抗體稀釋液 12ml×1
          ABC稀釋液 12ml×1
          TMB顯色液 10ml×1
          TMB終止液 10ml×1
          ELISA洗滌液 15ml×1(1:25)

          需要而未提供的試劑和器材
          1. 37℃恒溫箱。
          2. 標準規(guī)格酶標儀。
          3. 自動洗板機。
          4. 單通道或多通道可調節(jié)移液器以及其吸頭。
          5. 蒸餾水,容量瓶等
          6. 干凈的試管和Eppendof管。

          注意事項
          1. 開啟試劑盒之前要室溫平衡至少30分鐘。
          2. 配制各種試劑時,切記混勻!
          3. 用戶在初次使用試劑盒時,應將各種試劑管離心數(shù)分鐘,以便試劑集中到管底。
          4. 建議所有標準品、樣本都做雙份檢測。
          5. 要嚴格避免操作過程中酶標板干燥。干燥會使酶標板上生物成份迅速失活!
          6. 為免交叉污染,要避免重復使用手中的吸頭和試管。

          洗板方法
          手工洗板方法:吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內的液體;在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙,酶標板朝下用力拍幾次;將推薦的PBS或TBS洗滌緩沖液至少0.35ml注入孔內,浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要,重復此過程數(shù)次。
          自動洗板:如果有自動洗板機,應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

          樣品的準備和保存
          樣品如果不立即分析,應分裝后冷凍保存,且避免反復凍融。
          血清——用干凈試管收集血液,室溫凝固2小時或4℃過夜,離心1000×g 10分鐘,收集血清。立即分析或分裝后-20℃冷凍保存。
          細胞培養(yǎng)、組織勻漿、體液——離心去除沉淀,立即分析或分裝后-20℃冷凍保存。

          樣品稀釋的一般原則
          用戶須查閱文獻了解標本內待測因子的含量,決定適當?shù)南♂尡稊?shù),以使稀釋后樣品中待測因子的濃度處于ELISA試劑盒的*檢測范圍。樣品的稀釋應有詳細記錄。

          試劑的準備和保存
          A. 標準品的稀釋和使用:在使用前2小時內準備。將凍干品管內加入1ml樣品稀釋液,*溶解后做倍比稀釋。
          稀釋后的標準品在2小時內使用。

          B.生物素標記抗體工作液:在使用前2小時內準備。
          1. 根據(jù)每孔需要0.1ml計算總的用量(實際配制時應多配制0.1-0.2ml)。
          2. 按10ul生物素標記抗體加抗體稀釋液990ul的比例配制工作液。輕輕混勻。

          C.親和素-過氧化物酶復合物(ABC)工作液的準備:在使用前1小時內準備。
          1. 根據(jù)每孔需要0.1ml計算總的用量(實配時應多配制0.1-0.2ml)。
          2. 按10ul親和素-過氧化物酶復合物(ABC)加ABC稀釋液990ul的比例配制工作液。輕輕混勻。

          D. TMB顯色工作液的準備:在使用之前30分鐘,按TMB顯色液A 9份加 TMB顯色液B 1份的比例配制TMB顯色工作液。

          操作程序
          1. 確定本次檢測所需的已包被抗體的酶標板孔數(shù)目。
          2. 將倍比稀釋的標準品各0.1ml依次加入一排7孔中,1孔只加樣品稀釋液的作為對照。處理后的標本按100ul每孔加入。
          3. 酶標板加上蓋,37℃反應90分鐘。
          4. 反應后用自動洗板機吸去酶標板內的液體;或甩去酶標板內液體,再對著吸水紙拍幾下。洗滌2次。
          5. 將準備好的生物素抗體工作液按每孔0.1ml依次加入。37℃反應60分鐘。
          6. 0.01M TBS或0.01M PBS洗滌3次,每次浸泡1分鐘左右。
          7. 將準備好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入。37℃反應30分鐘。
          8. 0.01M TBS或0.01M PBS洗滌5次,每次浸泡1-2分鐘左右。
          9. 按每孔0.1ml依次加入TMB顯色工作液,37℃避光反應,反應過程中,要經(jīng)常的觀察,當肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度藍色,后3-4孔差別不明顯時,即可加入TMB終止液0.1ml/孔。(顯色反應zui長不要超過30分鐘)。
          10. 用酶標儀在450nm測定O.D.值。
          11. 根據(jù)樣品的吸光值在坐標上找出對應的濃度。用戶也可以使用各種應用軟件來計算。應記住由于樣品稀釋了N倍,其實際濃度應該×N。

          操作程序總結:
          準備試劑,樣品和標準品

          加入準備好的樣品和標準品,37℃反應90分鐘

          洗板2次,加入生物素化抗體工作液,37℃反應60分鐘

          洗板3次,加入ABC工作液,37℃反應30分鐘

          洗板5次,加入TMB顯色液,37℃反應

          加入TMB終止液

          30分鐘之內讀OD值

          計算標本待測因子含量

          檢測范圍:800ng/ml→12.5ng/ml。
          敏感性: <3ng/ml
          特異性: 系統(tǒng)和其它因子無交叉反應。
          保存: -20℃ [短期內(如兩周)可4℃]
          有效期: 12個月(-20℃)。
          用途: 用于體外定量分析液體標本(通用型)。

          REFERENCES
          1. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 81:2752-2756(1984).
          2. Gene 56:109-116(1987).
          3. Ann. N. Y. Acad. Sci. 646:140-154(1991).
          4. Blood 96:4071-4074(2000).
          5. Genome Res. 14:2121-2127(2004).
          6. Gene 49:167-175(1986).
          7. Nucleic Acids Res. 14:8692-8692(1986).
          8. J. Biol. Chem. 258:3543-3553(1983).
          9. J. Neurosci. Res. 61:388-395(2000).
          10. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 82:3149-3153(1985).
          11. Submitted (MAR-2007) to UniProtKB.
          12. Electrophoresis 16:1160-1169(1995).
          13. Hum. Genet. 100:457-458(1997).

           

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