實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>：驗(yàn)證沛歐SKD-200型凱氏定氮儀對低蛋白量樣品的檢測準(zhǔn)確度與度
實(shí)驗(yàn)設(shè)計人：沙金
實(shí)驗(yàn)執(zhí)行人：沙金
實(shí)驗(yàn)時期：2010-3-11
儀器與試劑：
凱氏定氮儀（SKD-200，上海沛歐分析儀器有限公司）
精密分析天平（FA2004，上海精科天平廠）
通風(fēng)櫥
水槽
500mL三角瓶若干
25mL酸式滴定管
50mL量筒
1mL移液器與槍頭
10mL離心管
藥匙
稱量紙
固體硫酸鉀/硫酸銅催化劑=3:1（w/w）
樣品1：0.5mg/mL BSA 2mL（containing 50% glycerol）
樣品2：0.5 mg/mL 大豆浸提液 2mL (containing 50% glycerol）
樣品3：標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨 (1mg N/mL)
空白對照：saline (containing 50% glycerol）
濃硫酸(AR)
35% NaOH
2% H3BO3
混合指示劑：0.1%溴甲酚綠乙醇溶液:0.1%甲基的紅乙醇溶液=5:1
0.1N NaOH
0.1N HCl
0.01037N 滴定用HCl
操作步驟：
1. 消化：
將預(yù)先稱量好的固體硫酸鉀/硫酸銅催化劑粉末約6g（可適當(dāng)加量）小心加入洗凈干燥的消化管底部；分別將樣品1、2和空白對照（約2mL）各兩份用分析天平差減法直接倒入消化管底部，記錄各組重量；用量筒小心稱取濃硫酸16mL加入各消化管底部。將消化管放在管架上，放入消化爐，啟動通風(fēng)櫥。設(shè)置消化溫度時間曲線：170℃（根據(jù)樣品碳化和沸騰的情況，可適當(dāng)提高或降低預(yù)消化溫度，并盡量避免樣品碳化沸騰掛壁以提高檢測準(zhǔn)確度），30min——250℃，10min——370℃（為保證消化效果，可根據(jù)情況適當(dāng)提高至400℃以上），120min。當(dāng)消化管內(nèi)出現(xiàn)穩(wěn)定的恒沸白色酸霧并回流時，可蓋上消化管蓋以減少硫酸損失。當(dāng)樣品被消化為明亮的藍(lán)綠色或綠色液體時，即可停止消化，待其冷卻至室溫后，取出蒸餾，關(guān)閉通風(fēng)櫥。
2. 蒸餾：
向凱氏定氮儀的三個儲液桶中分別加入足量的35%NaOH、2%H3BO3和蒸餾水（根據(jù)處理樣品量，至少1L），旋緊儲液桶蓋子。開機(jī)，打開循環(huán)水，不放入樣品，預(yù)蒸餾2min。向樣品管中小心加入20mL蒸餾水以稀釋硫酸，待其變?yōu)槊髁恋乃{(lán)色溶液時，小心放入蒸餾架，卡緊卡槽時注意將消化樣品管口卡緊以防止氨蒸氣流失；向500mL接收三角瓶中加入少量（約0.6mL）混合指示劑，并設(shè)定加硼酸12s，加堿8s，蒸餾8—9min，保存設(shè)置后啟動儀器。當(dāng)氨蒸氣隨冷凝水流出時（注意氨蒸氣管出口浸沒于接收三角瓶的硼酸溶液中），接收瓶中的硼酸溶液會由玫紅色變?yōu)樗{(lán)色，待蒸餾完畢，用蒸餾水將氨蒸氣管出口的殘液沖洗入接收瓶后取出待測。將樣品管取出，小心倒入水槽，并及時清洗。放入下一個樣品管和接收瓶，重復(fù)以上操作。蒸餾完畢后，關(guān)閉循環(huán)水。待蒸餾水冷卻后放出。如短時間內(nèi)不再使用定氮儀，應(yīng)用蒸餾水替換酸液和堿液，重復(fù)加酸加堿過程以清洗酸堿管路，維護(hù)設(shè)備。
3. 滴定
用0.1N NaOH、0.1NHCl、蒸餾水分別潤洗酸式滴定管各三次，zui后用0.01037N滴定用標(biāo)準(zhǔn)HCl潤洗兩三次。加入0.01037N滴定用標(biāo)準(zhǔn)HCl，并小心放液至0刻度。開始滴定，左手控制滴定速度，右手不斷搖動混勻三角瓶中溶液。（可預(yù)先對樣品消耗鹽酸量有一個大致的估計，即每毫升0.01N鹽酸可滴定約0.14mg氮）臨近滴定終點(diǎn)時溶液開始由藍(lán)色變?yōu)樗{(lán)灰色，在zui后一滴或半滴時微微呈現(xiàn)紫紅色。視線與滴定管水平時讀取并記錄鹽酸消耗量。用0.01037N滴定用標(biāo)準(zhǔn)HCl補(bǔ)滿至0刻度后，可滴定下一個樣品。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
1. 各組樣品取樣量：
| 空白對照 | BSA (0.5mg/mL) | 大豆浸提液(約0.5mg/mL) |
取樣前（g） | 9.823 | 9.191 | 9.702 |
*次取樣后（g） | 7.391 | 6.639 | 7.016 |
第二次取樣后（g） | 4.359 | 4.506 | 4.316 |
*次取樣量（g） | 2.432 | 2.552 | 2.686 |
第二次取樣量（g） | 3.032 | 2.133 | 2.700 |
*次取樣量（mg） | 0.00 | 1.1285 | 1.1878 |
第二次取樣量（mg） | 0.00 | 0.9432 | 1.1940 |
注：甘油密度1.2613g/mL，生理鹽水密度1.00 g/mL，則樣品溶液密度1.1307g/mL
蛋白取樣量（mg）= 取樣量（g）/ 樣品溶液密度 X 0.5 mg/mL
2. 各組樣品消耗鹽酸量：
| 空白對照 | BSA (0.5mg/mL) | 大豆浸提液(約0.5mg/mL) |
*次取樣量（g） | 2.432 | 2.552 | 2.686 |
第二次取樣量（g） | 3.032 | 2.133 | 2.700 |
*次鹽酸消耗量（mL） | 0.40 | 2.04 | 2.36 |
第二次鹽酸消耗量（mL） | 0.45 | 1.64 | 2.44 |
*次滴定氮量（mg） | 0.058 | 0.296 | 0.343 |
第二次滴定氮量（mg） | 0.065 | 0.238 | 0.354 |
平均氮含量(mg/mL) | 0.026 | 0.129 | 0.146 |
平均蛋白含量(mg/mL) | 0 | 0.577 | 0.724 |
檢測準(zhǔn)確度 |
| 高于真實(shí)值15.4% | 高于真實(shí)值約44.7% |
檢測度(SD%) | ±7.26% | ±2.75% | ±1.99% |
注：每消耗1mL0.01N的鹽酸相當(dāng)于0.14mg氮；動物膠K=5.6（N=18.0%），大豆制品K=6.0（16.7%）。
討論：
從檢測結(jié)果看，當(dāng)測量氮含量為0.18mg時，標(biāo)準(zhǔn)偏差控制在±3%以內(nèi)，而空白對照的含氮量進(jìn)一步下降為0.03mg時，標(biāo)準(zhǔn)偏差仍控制在±10%以內(nèi)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性較為理想。但兩組實(shí)驗(yàn)測量值均大于真值，分析原因：1）BSA組高15.4%，懷疑實(shí)驗(yàn)場所距動物房較近，造成結(jié)果偏高。2）大豆浸提液組高44.7%，懷疑不僅有1）的原因，而且浸提液中含有較高的非蛋白氮干擾，建議將浸提蛋白沉淀后再以凱氏定氮法測量。
另：以標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨檢測的蒸餾回收效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)?shù)繛?mg時，以1500W蒸餾器蒸餾8min，平均氮回收率為96.9%；以1500W蒸餾器蒸餾9min，平均氮回收率可達(dá)100%，蒸餾回收效果理想。建議對于低蛋白含量樣品測量而言，降低蒸餾器功率，并適當(dāng)延長蒸餾時間可進(jìn)一步改善回收率，從而使結(jié)果重復(fù)性更好
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