了解生化分析儀基本參數(shù)的原理，有利于儀器、試劑的正確使用，有助于正確分析和處理測(cè)定數(shù)據(jù)。但是，配套系統(tǒng)的原裝分析參數(shù)不宜更改；采用非儀器配套的試劑及校準(zhǔn)品體系時(shí)，參數(shù)修改要慎重，對(duì)于不同儀器、不同類型的反應(yīng)分析程序，所顯示的人機(jī)對(duì)話分析參數(shù)信息有所不同。
一、反應(yīng)監(jiān)測(cè)時(shí)間
對(duì)于終點(diǎn)法來(lái)說(shuō)，讀取反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)的吸光度計(jì)算樣品中待測(cè)物的濃度。對(duì)于連續(xù)監(jiān)測(cè)法來(lái)說(shuō)，要注意觀察反應(yīng)進(jìn)程曲線，從而確定反應(yīng)的預(yù)孵育期，延遲時(shí)間、連續(xù)監(jiān)測(cè)的時(shí)段。對(duì)于一級(jí)或偽一級(jí)反應(yīng)來(lái)說(shuō)，連續(xù)監(jiān)測(cè)的時(shí)間是一級(jí)反應(yīng)的動(dòng)態(tài)期的吸光度；對(duì)于基于零級(jí)反應(yīng)的酶催化活性濃度速率法測(cè)定，連續(xù)監(jiān)測(cè)的是零級(jí)線性反應(yīng)期的吸光度。對(duì)于連續(xù)監(jiān)測(cè)法來(lái)說(shuō)，動(dòng)態(tài)反應(yīng)期的時(shí)間越長(zhǎng)，越適用于臨床應(yīng)用，對(duì)于以酶為工具的代謝物酶促動(dòng)力測(cè)定法，要增加動(dòng)態(tài)反應(yīng)期，即延長(zhǎng)反應(yīng)達(dá)到平衡的時(shí)間，可在反應(yīng)體系中加入競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，這樣還可以提高測(cè)定的線性范圍，對(duì)于酶催化活性濃度連續(xù)監(jiān)測(cè)法來(lái)說(shuō)，一定要注意線性反應(yīng)時(shí)間，有的酶，例如，以硫代丁酰膽堿為底物的血清假性膽堿酯酶速率測(cè)定法，線性反應(yīng)時(shí)間只有90秒。對(duì)于連續(xù)監(jiān)測(cè)法來(lái)說(shuō)，在監(jiān)測(cè)期至少應(yīng)讀4個(gè)點(diǎn)(3個(gè)△A)。
多數(shù)全自動(dòng)生化分析儀可以在整個(gè)測(cè)定反應(yīng)周期連續(xù)監(jiān)測(cè)(如HITACHI7170常規(guī)測(cè)定周期10分鐘、監(jiān)測(cè)34點(diǎn)，OLYMPUSAU600固定周期8分15秒、監(jiān)測(cè)27點(diǎn))，但反應(yīng)監(jiān)測(cè)時(shí)間是指該時(shí)間內(nèi)的測(cè)定讀數(shù)要用于結(jié)果計(jì)算。它的設(shè)置與加樣點(diǎn)、加試劑點(diǎn)(包括R1、R2……)、監(jiān)測(cè)時(shí)間(讀數(shù)點(diǎn))、讀數(shù)間隔時(shí)間及試劑樣品比例等有關(guān)，要結(jié)合方法學(xué)，兼顧權(quán)衡。
1.反應(yīng)時(shí)間(ReactionTime)指儀器的一個(gè)分析周期中，試劑和樣品混合末一點(diǎn)測(cè)定讀數(shù)時(shí)間。它對(duì)終點(diǎn)法尤其重要，是終點(diǎn)法的瓶頸。有的儀器多個(gè)反應(yīng)時(shí)間可選L如Hl—TACHI7170)，須預(yù)先選定。多數(shù)儀器10分鐘左右，這對(duì)試劑提出了較高要求。不少終點(diǎn)法試劑(尤其手工法試劑)反應(yīng)時(shí)間常常也在lO分鐘上下，測(cè)定時(shí)間沒(méi)有余地，當(dāng)樣品濃度高或試劑質(zhì)量下降時(shí)，均可致測(cè)定結(jié)果偏低。因此，終點(diǎn)法不宜采用標(biāo)明反應(yīng)時(shí)間接近和長(zhǎng)于儀器大反應(yīng)時(shí)間的試劑盒。否則，必須用接近測(cè)定范圍上限的高濃度質(zhì)控血清監(jiān)測(cè)。
2.監(jiān)測(cè)時(shí)間(讀數(shù)點(diǎn))和讀數(shù)間隔時(shí)間各類型儀器不盡一致。離心式生化儀讀數(shù)間隔時(shí)間短，監(jiān)測(cè)時(shí)間也短。流動(dòng)式生化儀讀數(shù)間隔時(shí)間一般較長(zhǎng)。分立式生化儀一般監(jiān)測(cè)時(shí)間10分鐘左右，間隔10-30秒讀數(shù)一次。有的儀器在整個(gè)測(cè)定反應(yīng)周期全程讀數(shù)，有的只讀取時(shí)間(點(diǎn))的吸光度。
3.加試劑點(diǎn)采用雙試劑時(shí)，加R2點(diǎn)決定R1與樣品的反應(yīng)時(shí)間，也決定R2與R1及樣品的反應(yīng)時(shí)間。一般儀器各5分鐘左右。HITACHI7170有4個(gè)加試劑點(diǎn)，若采用雙試劑，各5分鐘，則加R2設(shè)在第3加試劑點(diǎn)。
4反應(yīng)監(jiān)測(cè)時(shí)間還要考慮延遲時(shí)間的長(zhǎng)短、測(cè)定物質(zhì)的濃度范圍及相關(guān)臨床價(jià)值和工作效率等因素。
二、延遲時(shí)間
延遲時(shí)間(DelayTime)指試劑與樣品混合后到監(jiān)測(cè)開(kāi)始之間的時(shí)間。一般用于兩點(diǎn)法和速率法，某些情況下也用于終點(diǎn)法。終點(diǎn)法應(yīng)選擇反應(yīng)趨于平衡的時(shí)間(穩(wěn)定期或平衡期)作測(cè)定，測(cè)定點(diǎn)前即所謂的孵育期。速率法的線性反應(yīng)期之前即延遲期。正確選擇延遲時(shí)間的長(zhǎng)短，有利于準(zhǔn)確測(cè)定，減少試驗(yàn)誤差。設(shè)置一般根據(jù)試劑盒的說(shuō)明書，還應(yīng)考慮本室的儀器特點(diǎn)和工作程序。
1.儀器特點(diǎn)比如，半自動(dòng)生化儀多為流動(dòng)比色池，要考慮泵速、進(jìn)樣管長(zhǎng)短、反應(yīng)液黏稠度及混合情況，以及室溫、反應(yīng)液溫度同反應(yīng)要求溫度間的溫差等。全自動(dòng)生化儀的測(cè)定讀數(shù)設(shè)置方式不同，直接以“秒”設(shè)置，或以測(cè)定點(diǎn)設(shè)置、測(cè)定點(diǎn)間隔時(shí)間不一樣，需要靈活掌握。
2.試劑及方法學(xué)
(1)試劑組成在酶活性的連續(xù)監(jiān)測(cè)法時(shí)，若試劑含工具酶數(shù)量多、偶聯(lián)反應(yīng)多，則激活反應(yīng)時(shí)間一般較長(zhǎng)，延遲時(shí)間也較長(zhǎng)，如肌酸激酶(NAC法)延遲時(shí)間常設(shè)置120-180秒；若試劑中底物經(jīng)待測(cè)酶催化，其產(chǎn)物可以直接測(cè)定的，則延遲時(shí)間較短，如-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)設(shè)定30-60秒。同一項(xiàng)目同一方法，但試劑配方不同，其反應(yīng)快慢等特征也可能不同，如白蛋白測(cè)定。白蛋白與溴甲酚綠(BCG)為即時(shí)反應(yīng)，10秒鐘內(nèi)已完成，其后球蛋白等也將與BCG發(fā)生反應(yīng)，所以孵育時(shí)間不能延長(zhǎng)。但在同一測(cè)定時(shí)間，BcG濃度、緩沖液種類、pH和表面活性劑不J司的試劑，測(cè)定結(jié)果可能差異明顯。
(2)樣品異常成分干擾有的試驗(yàn)項(xiàng)目需要用工具酶將內(nèi)源性代謝產(chǎn)物耗盡，比如丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性測(cè)定試劑中須有足量的乳酸脫氫酶(LDH)。如果使用單試劑，正常血清樣品延遲時(shí)間60秒即可；但當(dāng)內(nèi)源性酮酸增多(如酮癥酸中毒)時(shí)，試劑內(nèi)LDH常常不能在60秒內(nèi)*將其清除，剩余酮酸會(huì)進(jìn)入監(jiān)測(cè)期干擾測(cè)定，使測(cè)定結(jié)果偏高，所以延遲時(shí)間應(yīng)增至90～120秒。采用雙試劑，則可在加入R1后即進(jìn)入預(yù)孵育期。
(3)方法學(xué)要求比如肌酐(Jaffe法)測(cè)定的特異性不強(qiáng)，一般認(rèn)為反應(yīng)前20秒左右為乙酰乙酸等快反應(yīng)干擾物呈色，后約80～100秒為蛋白質(zhì)等慢反應(yīng)假肌酐呈色，20~60秒肌酐呈色反應(yīng)占主導(dǎo)地位。采用兩點(diǎn)法或速率法可減少干擾，但具體取多長(zhǎng)的延遲時(shí)間，應(yīng)根據(jù)試劑和儀器讀數(shù)特點(diǎn)，以干擾試驗(yàn)等方法來(lái)評(píng)價(jià)決定。
3.工作程序要在保證準(zhǔn)確性的前提下，合理設(shè)置參數(shù)，提高工作效率。突出的例子是半自動(dòng)生化儀上酶活性連續(xù)監(jiān)測(cè)法的延遲時(shí)間設(shè)定。由于只能單份樣品逐一測(cè)定，若延遲時(shí)問(wèn)全部設(shè)置在儀器內(nèi)，每個(gè)延遲時(shí)間加監(jiān)測(cè)時(shí)間至少1分鐘以上，守候時(shí)間較長(zhǎng)。工作量大時(shí)，可以根據(jù)儀器控溫、加樣及讀數(shù)和試劑特點(diǎn)，以及室溫情況，將延遲時(shí)問(wèn)挪一部分到機(jī)外，套式操作，但要確保機(jī)內(nèi)延遲時(shí)間不要進(jìn)入線性反應(yīng)期。
4.要兼顧延遲時(shí)間和監(jiān)測(cè)時(shí)間反應(yīng)時(shí)間是有限制的。在速率法和兩點(diǎn)法中，延長(zhǎng)延遲時(shí)間必然縮短線性監(jiān)測(cè)期，減少測(cè)定的線性范圍，也易發(fā)生底物耗盡。
三、樣品量、試劑量與稀釋量
有關(guān)參數(shù)包括樣品量、試劑量、稀釋水量、小反應(yīng)體積和大比色杯容量等。如HITACHI7170反應(yīng)體積180~380µl，大體積570µl。BT224半自動(dòng)生化儀流動(dòng)比色池容積33µl，吸液量200～990µl，適體積500µl。
1.小反應(yīng)體積在儀器光度讀數(shù)要用于結(jié)果計(jì)算時(shí)，反應(yīng)液液面高度不低于光度計(jì)光徑的小體積。它保證儀器的正確讀數(shù)和計(jì)算，也是儀器測(cè)定精度和經(jīng)濟(jì)性的指針之一。在有的儀器中，它以反應(yīng)體積的下限表示，有的則專門標(biāo)明小反應(yīng)體積。在單試劑測(cè)定中，樣品與試劑的總體積不得少于此參數(shù)。在雙試劑測(cè)定中，若R1與樣品的反應(yīng)讀數(shù)不納入結(jié)果計(jì)算。R1自勺加液量可不考慮此參數(shù)，如連續(xù)監(jiān)測(cè)法；否則應(yīng)考慮它對(duì)結(jié)果的影響，如終點(diǎn)法在加R2之前讀數(shù)，并以此來(lái)扣除試劑或樣品空白時(shí)。
在半自動(dòng)生化儀中，適吸人量相當(dāng)于少反應(yīng)體積。它與進(jìn)液管道長(zhǎng)度、流動(dòng)比色池容積，吸液泵抽吸力大小和液體黏稠度有關(guān)，它要保證光度檢測(cè)不受空泡和前后樣品攜帶污染的干擾。因此，吸人體積不能任意降低，必要時(shí)，應(yīng)加大反應(yīng)液量和吸人量。
2.大比色杯容量這個(gè)參數(shù)含義明確。在有的儀器中，它以反應(yīng)體積的上限表示，有的則專門標(biāo)明大比色杯容量。反應(yīng)液超過(guò)此體積，將致液體外溢，儀器測(cè)定系統(tǒng)被污損。
3.樣品試劑比例樣品與試劑的比例(SV：RV)，也可表示為樣品體積分?jǐn)?shù)——樣品體積與反應(yīng)液總體積的比值(SV/TV)，是方法學(xué)基本參數(shù)。酶活力測(cè)定中，樣品在總體積中的比例應(yīng)在10%以下。一般來(lái)說(shuō)，待測(cè)物質(zhì)在樣品中含量低的、生理波動(dòng)范圍大的，樣品用量較大。如Trinder反應(yīng)測(cè)定血清葡萄糖、膽固醇等，樣品試劑比例多為1：1OO，測(cè)定血尿酸或高密度脂蛋白膽固醇，常增加為1：50；ALT和AST的樣品試劑比例多為1：1O至1：20。方法靈敏、吸光度高的實(shí)驗(yàn)方法，樣品試劑比例小,如白蛋白BCG法，樣品試劑比例常為1：200。肌酐Jaffe氏法監(jiān)測(cè)時(shí)間短、吸光度值較低，樣品試劑比例多為1：10。一般應(yīng)以試劑說(shuō)明為準(zhǔn)，不宜輕易改動(dòng)。
(1)改動(dòng)樣品試劑比例，影響一系列方法學(xué)參數(shù)。若比例增大，則線性范圍縮小，線性反應(yīng)時(shí)間縮短，樣品內(nèi)源性干擾、基質(zhì)效應(yīng)增加、旁路反應(yīng)會(huì)增強(qiáng)，方法特異性也下降。若比例減少，檢測(cè)信號(hào)偏低，信噪比(噪音/信號(hào))增大，當(dāng)儀器精度不高時(shí)，會(huì)加大測(cè)量誤差。
(2)改動(dòng)樣品試劑比例，對(duì)某些反應(yīng)有影響。如堿性磷酸酶(AI_P)，有文獻(xiàn)報(bào)道：當(dāng)樣品試劑比例從1：25降至1：50時(shí)，酶活力測(cè)定值增加，再低于1：50時(shí)不再增加。這一效應(yīng)可能是較高稀釋度下AIJP多聚體解聚的結(jié)果。體液樣品稀釋也可能對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生影響：④大多數(shù)蛋白質(zhì)在濃溶液中的分子構(gòu)象比稀溶液中穩(wěn)定，樣品稀釋可影響酶的穩(wěn)定性。(2)降低樣品中內(nèi)源性抑制劑或激動(dòng)劑的濃度，如以蒸餾水稀釋血清，可能因降低血清中淀粉酶的激動(dòng)劑氯離子的濃度，致測(cè)定淀粉酶結(jié)果偏低；隨血清稀釋倍數(shù)增加，肌酸激酶測(cè)定活力增加，可能與降低樣品中AMt，、胱氨酸等內(nèi)源性抑制劑有關(guān)。
(3)雙試劑時(shí)要兼顧R1、R2和樣品三者的比例，尤其不宜改動(dòng)試劑間的比例。R2要考慮儀器規(guī)定的加液小體積，同一試劑瓶死體積下分液量小而浪費(fèi)大的經(jīng)濟(jì)問(wèn)題等。
4.稀釋(水)量在加樣或加試劑時(shí)，加入去離子水或可以的液體。它的主要用途有兩個(gè)。一是用于濃縮試劑的稀釋，或樣品、校準(zhǔn)品的稀釋。二是在樣品加量小的時(shí)候用來(lái)沖洗樣品探針，減小攜帶誤差；但用量不宜太多，以免稀釋試劑影響反應(yīng)。要把稀釋水量納入樣品試劑比例和反應(yīng)液總體積考慮。必要時(shí)，干粉試劑復(fù)溶也要考慮此因素。
四、試劑空白(Reagentblank)監(jiān)測(cè)參數(shù)
無(wú)樣品或以水代替樣品在反應(yīng)過(guò)程中觀察試劑空白值或其變化情況，主要用于監(jiān)測(cè)試劑質(zhì)量及儀器穩(wěn)定性，利用試劑空白對(duì)試劑本身或反應(yīng)漂移引起的誤差進(jìn)行補(bǔ)償，用以校正△A或△A/min。它與測(cè)定波長(zhǎng)、光徑大小、不同試劑及配方和樣品試劑比例等有關(guān)，不能盲目套用，必要時(shí)宜實(shí)際測(cè)定。
1.試劑吸光度上限和下限定點(diǎn)監(jiān)測(cè)試劑的吸光度。它常用規(guī)定波長(zhǎng)及光徑下的吸光度值表示。儀器的試劑空白檢測(cè)點(diǎn)因儀器和測(cè)定方法的不同而有差異。終點(diǎn)法常在PO點(diǎn)讀數(shù)，連續(xù)監(jiān)測(cè)法常以反應(yīng)監(jiān)測(cè)起始點(diǎn)來(lái)判讀。儀器在試劑空白檢測(cè)及相關(guān)的校準(zhǔn)測(cè)定時(shí)，若監(jiān)測(cè)到超過(guò)此參數(shù)的限值，則提示試劑失效或校準(zhǔn)無(wú)效。反應(yīng)吸光度向上的試驗(yàn)取上限值：如Trinder反應(yīng)以酚或2-羥-3，5-二氯苯磺酸等和4-氨基安替比林作用，生成紅色素，試劑有一定的自發(fā)氧化，其試劑一般要求試劑吸光度上限≤0.1-0.4。以結(jié)合型硝基苯衍生物作為底物的ALP和GGT常要求≤0.6~0.8。反應(yīng)吸光度向下的試驗(yàn)取下限值：如以NADH或NADPH為輔酶的ALT和Urea(紫外法)等試驗(yàn)，一般要求試劑吸光度下限≥1.0。
2.試劑空白速率顧名思義，它是在反應(yīng)過(guò)程中對(duì)試劑空白的變化速率作連續(xù)監(jiān)測(cè)，其數(shù)值在樣品測(cè)定結(jié)果中自動(dòng)扣除。試劑中可能混有的其他雜酶或干擾物對(duì)試劑空白速率有影響。在酶促反應(yīng)中，試劑空白速率也是試劑在監(jiān)測(cè)過(guò)程中底物自發(fā)降解的結(jié)果。底物為還原型輔酶者，本身不穩(wěn)定而分解，多呈下降趨勢(shì)；以硝基苯酚或苯胺的衍生物作底物，在堿性環(huán)境中自發(fā)水解成被測(cè)物質(zhì)，多呈上升趨勢(shì)。此參數(shù)主要用于連續(xù)監(jiān)測(cè)法。一般認(rèn)為酶活性測(cè)定的試劑空白速率(△A/min)應(yīng)≤0.001~0.003。由于試劑空白速率與儀器檢測(cè)下限、正常參考范圍下限等指標(biāo)有關(guān)，有時(shí)也以濃度單位表示。要根據(jù)K值、儀器穩(wěn)定性、方法允許變異而定。例如，ALT或AST40U/L以下活力濃度的分析誤差應(yīng)≤10%，其試劑空白速率應(yīng)≤4.0U/L。一些儀器的程序參數(shù)中沒(méi)有此參數(shù)，但我們應(yīng)在試劑空白的測(cè)定資料中關(guān)注它，若資料波動(dòng)大，須查找試劑或儀器原因。
3.試劑空白的日常監(jiān)測(cè)測(cè)定方法設(shè)置了試劑空白的項(xiàng)目，都要先行作試劑空白測(cè)定，在樣品測(cè)定計(jì)算中自動(dòng)扣除。由于試劑空白不是在每一個(gè)樣品測(cè)定中實(shí)時(shí)測(cè)定并扣除，當(dāng)樣品測(cè)定中試劑的變化在未達(dá)到參數(shù)設(shè)置限值時(shí)不易發(fā)現(xiàn)，試劑空白扣除會(huì)產(chǎn)生誤差。所以，應(yīng)根據(jù)試劑的穩(wěn)定性確定試劑空白及相關(guān)的校準(zhǔn)的測(cè)定頻率。連續(xù)監(jiān)測(cè)法的試劑應(yīng)每天(尤其在換另瓶或另批號(hào)試劑時(shí))常規(guī)測(cè)定此參數(shù)。對(duì)樣品的異常結(jié)果.也應(yīng)及時(shí)對(duì)其測(cè)定吸光度資料(包括與試劑空白有關(guān)的資料，例如PO點(diǎn)讀數(shù))觀察分析。
4.有的半自動(dòng)生化儀沒(méi)有試劑吸光度上限和下限設(shè)定，但一般在測(cè)定屏幕都顯示初始吸光度值，應(yīng)人工加以判斷。酶活力測(cè)定結(jié)果呈負(fù)值，有時(shí)可能與試劑空白錯(cuò)誤有關(guān)。
5.試劑吸光度上限和下限不是試劑質(zhì)量的指針。因此，一定的校準(zhǔn)頻率和室內(nèi)質(zhì)控是質(zhì)量保證的必需手段。我們?cè)趯?shí)際工作中就遇到酶活力測(cè)定的試劑空白數(shù)據(jù)在規(guī)定限值內(nèi)，但質(zhì)控物測(cè)定結(jié)果連續(xù)偏低，病人結(jié)果因每天標(biāo)本少而難以判斷，后發(fā)現(xiàn)是試劑質(zhì)量下降。
五、波長(zhǎng)的選擇及測(cè)定模式
波長(zhǎng)(Wave1ength)的正確選擇有利于提高測(cè)定的靈敏度和減少測(cè)定誤差。光度學(xué)方法有單波長(zhǎng)和雙波長(zhǎng)之分，有的儀器可用三波長(zhǎng)、甚至多波長(zhǎng)，以及兩波長(zhǎng)比率等。有的儀器可作導(dǎo)數(shù)光譜分析。單波長(zhǎng)測(cè)定易受樣品溶血、黃疸、脂濁等因素干擾。雙波長(zhǎng)測(cè)定可以通過(guò)副波長(zhǎng)加以修正，減少甚至消除干擾因素，提高測(cè)定準(zhǔn)確性。采用同光束雙波長(zhǎng)，亦有利于排除光源強(qiáng)度變化對(duì)結(jié)果的影響。
1.測(cè)定波長(zhǎng)選擇有三個(gè)主要條件：
(1)待測(cè)物質(zhì)在該波長(zhǎng)下的光吸收大。
(2)其吸收峰宜較寬而鈍，而不是處于尖峰或陡肩，一般不選光譜中的末端吸收峰，換句話說(shuō)，該吸收峰處的吸光度隨波長(zhǎng)變化較小。
(3)常見(jiàn)干擾物在該波長(zhǎng)下的光吸收小。試劑盒說(shuō)明一般已提供波長(zhǎng)參數(shù)。實(shí)際波長(zhǎng)選擇需要了解待測(cè)物質(zhì)和干擾組分對(duì)不同波長(zhǎng)單色光的吸收程度，即以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)作吸收光譜曲線(光吸收曲線)。
采用透射免疫比濁法，免疫復(fù)合物大小約35~100mn之間，于波長(zhǎng)290~410nm下有大吸收峰，常取340nm；如用膠乳增強(qiáng)免疫濁度法，理想的檢測(cè)波長(zhǎng)可增至可見(jiàn)光區(qū)。
2.雙波長(zhǎng)測(cè)定當(dāng)待測(cè)物質(zhì)與干擾組分的吸收光譜互相重疊、出現(xiàn)非特異光吸收，或因反應(yīng)液混濁出現(xiàn)光散射時(shí)，可以采用雙波長(zhǎng)(或多波長(zhǎng))測(cè)定。雙波長(zhǎng)測(cè)定的原則是根據(jù)干擾組分和待測(cè)物質(zhì)吸收光譜的峰形特征，選擇兩個(gè)波長(zhǎng)和，使干擾組分在這兩個(gè)波長(zhǎng)處的吸光系數(shù)相等，而使待測(cè)物質(zhì)在兩波長(zhǎng)處的吸光系數(shù)有顯著差別。以兩波長(zhǎng)分別測(cè)定分析溶液的吸光度，以兩個(gè)吸光度值之差(△A)計(jì)算。雙波長(zhǎng)選擇常見(jiàn)：血紅蛋白340nm和380nm波長(zhǎng)吸光度相同，以NADH或NADPH作為測(cè)定底物或產(chǎn)物的試驗(yàn)常采用340/380nm；有的也.采用340/405nm。ALP和GGT常使405/476nm，Trinder反應(yīng)多選取520/600nm或550/660nm.免疫比濁常選用340/700nm等。
連續(xù)監(jiān)測(cè)法中，要注意雙波長(zhǎng)測(cè)定有兩種類型的機(jī)型：主波長(zhǎng)全程監(jiān)測(cè)副波長(zhǎng)單點(diǎn)監(jiān)測(cè)，和雙波長(zhǎng)全程監(jiān)測(cè)。不僅因?yàn)楹笳叩臏?zhǔn)確性優(yōu)于前者，而且因?yàn)槊富钚詼y(cè)定的K值計(jì)算與波長(zhǎng)及摩爾吸光系數(shù)有關(guān)，更顯重要。
副波長(zhǎng)單點(diǎn)監(jiān)測(cè)：試劑和樣品混合后，雙波長(zhǎng)只測(cè)一點(diǎn)，此后只用主波長(zhǎng)連續(xù)監(jiān)測(cè)；計(jì)算時(shí)，全部x主吸光度值均減去同一λ副吸光度值。K值計(jì)算代入主波長(zhǎng)摩爾吸光系數(shù)即可。機(jī)型如Monarch1000，TechniconRA1000等。
雙波長(zhǎng)全程監(jiān)測(cè)：全程每～測(cè)定點(diǎn)均用雙波長(zhǎng)同測(cè)，并各自用λ主吸光度值減去λ副吸光度值。因?yàn)樗鶞y(cè)指示酶或產(chǎn)物在λ副波長(zhǎng)時(shí)也存在一定的吸光系數(shù)，K值計(jì)算代入的摩爾吸光系數(shù)值應(yīng)采用ε主減去ε副。如NADH的ε為6.22×10，為1.33×10，ALP產(chǎn)物ε為18.5x×10，ε為0.2×10很??；GGT產(chǎn)物在副波長(zhǎng)處無(wú)吸光系數(shù)。
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