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顯微應用 | 癌癥免疫學中的3D超多標成像（上）
癌癥免疫學中的3D多標記成像可更好地表征組織變化和細胞相互作用。本文介紹了一種在STELLARIS 共聚焦平臺上進行3D成像的單次、超多標工作流程，用于小鼠腫瘤組織成像。通過優(yōu)化成像設置和先進的拆分技術，我們準確地拆分了來自15種標記物的信號，實現(xiàn)了細胞類型和功能狀態(tài)的精確識別。這種方法為癌癥研究提供了全面的工具，有助于深入理解腫瘤微環(huán)境。
在成像時保持染料的光譜重疊盡可能低至關重要，但在如此高密度的多標記樣本中，串色無法wanquan避免。
在這種超多標水平上，拆分工具提供了一種識別和量化每個標記物貢獻的方法。
傳統(tǒng)方法中，單獨染色一個樣本（每個標記物一個）作為拆分的對照和起點。對照樣本中獲取的信息用于構建拆分矩陣。單染色方法比較繁瑣，因為這需要大量的樣本和精力，來創(chuàng)建與多重標記數(shù)量相同數(shù)量的樣本。
圖2：超多標實驗中創(chuàng)建對照數(shù)據(jù)的新策略。a–c,腫瘤對照樣品（頂部）分別對5種不同標記物進行了部分染色，創(chuàng)建了3組標記子集，以最小化串色可能的前提下涵蓋所需的15種染料對照（中間）。在成像工作流程中，對每組部分染色的樣本進行全通道采集（目標圖像，底部），這些圖像用于生成15標拆分矩陣。
由于樣本通常稀缺且難以獲得， SpectraPlex提供了一種便利的節(jié)省樣本的替代方案：不用準備一組單獨的單染色樣本，用戶會得到一組含有染料子集的對照樣本的制備建議。在我們的示例中，我們創(chuàng)建了一套三個組織切片，每個切片分別染色15標面板中的5個標記（即“Group"方法；圖2a–c，上方），并使用工作流程建議的設置進行成像。結果顯示出無串色的5通道模板，可構建拆分矩陣（圖2a–c，中間）。第二步，我們在同一視野內使用推薦設置對完整的15標通道進行成像（圖2a–c，下方）。這兩步的信息用于創(chuàng)建整體拆分矩陣。
圖3：小鼠胰腺腫瘤切片的3D 15標成像。a, 使用SpectraPlex功能對染色并拆分后的腫瘤切片進行成像的概覽。比例尺：500 µm。b–g, 從15標中提取的成像通道中的生物靶標細節(jié)，以便于展示。比例尺：50 µm。b, 淋巴細胞：B220（薄荷綠色）、CD4（青色）和CD8（黃色）。c, T細胞及抗原，解析其功能狀態(tài)：CD4（青色）、CD8（黃色）、PD1（紫色）、FoxP3（白色）和TCF1（棕褐色）。d, 髓系細胞：CD11b（天藍色）、CD11c（紅色）和MHC II（棕色）。e, 增殖細胞和基質抗原：Ki67 （深藍色）、α-SMA（橙色）和Tenascin C（森林綠色）。f, 癌上皮細胞和基質細胞功能狀態(tài)：E-鈣 黏蛋白（玫瑰色）和MHC I（綠色）。周圍的細胞外基質：Tenascin C（森林綠色）。g, 增殖細胞和成纖維細胞：Ki67（深藍色）和α-SMA（橙色）。血管內皮細胞：CD31（柑橘綠色）。
計算出拆分矩陣后，使用相應的設置對完整的15標樣本進行采集。拆分后的數(shù)據(jù)會自動生成（圖 3），并附上對應的原始圖像，方便后續(xù)分析和解釋。帶有所有生物相關通道的樣本片段展示了單輪染色方法的豐富信息（圖3a）。
癌癥樣本的詳細視圖展示了不同的微環(huán)境。例如，富含淋巴細胞的區(qū)域（B 和T細胞）展示了免疫系統(tǒng)在腫瘤中已經(jīng)開始執(zhí)行功能（圖3b）。這些淋巴細胞大多具備免疫功能，直接或間接抵抗腫瘤生長（圖3c中TCF1和PD1的表達），其中部分細胞還具有調節(jié)作用（圖3c中FoxP3的 表達）。髓系細胞在腫瘤中通常更為常見，功能各異，可發(fā)揮抗腫瘤或促腫瘤作用，其空間分布在很小尺度上呈現(xiàn)顯著差異（圖3d）。
樣本中的癌癥、基質和細胞外基質標記物表現(xiàn)出較高的異質性。雖然這些標記物的分布較為復雜（例如，成纖維細胞的細胞過程），但它們也明顯覆蓋了大片上皮和內皮細胞區(qū)域（圖3e–g）。高級拆分程序確保在組織內準確識別不同的細胞類型及其功能狀態(tài)（例如，免疫細胞亞型、組織決定因子和疾病決定因子）。
總體而言，建立一種穩(wěn)健、快速且靈活的3D成像方法以評估癌癥組織對于解析腫瘤微環(huán)境的變化至關重要。該成像工作流程的高效性可以加速結果評估、決策制定，并為后續(xù)實驗設計提供有力支持。
一次性成像方法為此工作流程帶來了兩項關鍵優(yōu)勢。首先，能夠對與癌癥標記物相關的感興趣區(qū)域（ROIs）進行深入探索，例如在不同放大倍數(shù)和更高分辨率下進行更詳細的空間特征分析。其次，所有標記物在三維環(huán)境中同時存在，確保在組織中發(fā)現(xiàn)的相互作用置于其預期或意料之外的組織微環(huán)境中進行分析。
總結
summarize
本研究展示了15種標記方法的成功應用，并為推動癌癥研究提供了重要的工具，能夠更好地表征腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞類型和亞型、癌癥組織的免疫響應以及對潛在治療的反應。
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