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技術(shù)文章
分析影響ELISA中非特異性顯色的原因
點擊次數(shù)：2172 發(fā)布時間：2009-11-13
影響ELISA中非特異性顯色的原因很多，如試劑盒特異性、檢驗標本中含酶標記物的干擾物，操作過程中的問題。本文就這一原因作一簡要分析,以便可以通過以上措施把非特異顯色降至zui低限度，從而提高檢測的特異性，并得到更準確、可靠的實驗結(jié)果。
1、試劑盒特異性因素
1、1 固相載體的選擇。ELISA中常用的固相載體有微量滴定板、小珠和小試管三種，以微量滴定板zui為常見[1]。它具有良好的吸附性能，孔底透明度高，空白值低，各板之間、同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別，各產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大。因此，在選擇試劑盒同時要對其使用的微孔板型號進行認證，評估。
1、2包被物的純度。在酶聯(lián)免疫測定尤其是間接ELISA中，試劑的特異性取決于使用抗原的純度。目前由于技術(shù)條件的限制，包被用抗原或抗體的純度不可能達到100%，所以有些非特異性顯色不可避免，只能盡可能提高純度，提高特異性。目前使用的包被抗原一般為合成多肽抗原。
1、3包被抗體的效價。具有高親和力和高特異性的包被抗體，是決定試劑特異性的重要方面。
1、4 封閉。是ELISA中重要的一步，目的是封閉固相載體表面尚未被所占據(jù)的空隙[2]，減少后續(xù)步驟中非特異性蛋白的干擾。
2、檢驗標本中含有酶標記物的干擾物
2、1內(nèi)源性干擾物：類風濕因子（RF）、黃疸等，類風濕因子是可作用于多種動物以及人IgGFc段的自身抗體，多數(shù)為IgM類，能充當抗原成分與固相及酶標抗體反應，從而呈現(xiàn)非特異性顯色。
黃疸血標本中常含有內(nèi)源性過氧化物酶，如用辣根過氧化物酶為標記物，就有可能產(chǎn)生非特異性顯色。
2、2 外源性干擾物，常常因樣品采集、貯存、處理不當造成如樣品溶血，被細菌污染，標本凝集不全等。溶血標本，紅細胞溶解破裂，釋放出血紅素形成，而血紅素中的鐵卟啉是過氧化物酶的類似物，以HRP為標記的ELISA測定中，溶血標本可能會增加非特異性顯色。如有細菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP（辣根過氧化酶）[2]，有國內(nèi)報道酶免HBsAg試劑檢測溶血標本時可造成假陽性[3]。如在冰箱中保存過久，其中的IgG可發(fā)生聚合，在間接法ELISA中可使本底加深[2]。因此，血標本在采集處理時應小心，在冰箱中保存不易過久。
標本凝集不全時，血清中會殘留部分纖維蛋白原，也易造成假陽性。
3、操作過程中的問題造成假陽性
3、1加樣
對于間接ELISA標本一般都要進行稀釋，如果加樣不準就會造成誤差，尤其當稀釋倍數(shù)大時，很小的誤差，會導致較大的相對誤差，使陰性（或弱陽性）標本呈陽性（或陰性）。加樣時應將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。目前，大部分血站都已使用全自動酶免加樣系統(tǒng)處理標本，可較好地避免以上誤差。
3、2洗滌
在ELISA中正確的洗滌是保證得到可重復結(jié)果的關(guān)健一步，應引起操作者重視。無論是手工操作還是機器操作，得出不正確的結(jié)果常與不正確的洗滌有關(guān)，ELISA就是靠洗滌來達到分離游離和結(jié)合的酶標記物的目的。通過洗滌以消除殘留在板孔中沒能與固體抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。
3、3 溫育
每種試劑都有其*反應模式，其中溫度和溫育時間控制是重要因素。因孵育溫度高，反應時間長，會造成整板本底高，陽性率高。溫育一般用濕盒或水浴，反應板不宜疊放，以保證各板溫度都能迅速平衡，為避免蒸發(fā)，板上應加蓋。
3、4酶標儀判讀
作為記錄測定結(jié)果的儀器，酶標儀的性能穩(wěn)定與否，決定結(jié)果的可靠度。首先酶標儀應定期進行保養(yǎng)，對濾光片要定期校正；其次酶標儀波長設(shè)置要正確，使用雙波長，一個檢測波長，一個參比波長，以消除微孔板底部劃痕、不平、指印或液面高度差異造成的光干擾。此外，在用酶標儀讀數(shù)時先擦試微孔板底部并壓平板條。由于各種酶標儀性能有所不同，使用中應詳細閱讀說明書
綜上所述，由于酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)目前在技術(shù)上缺乏標準化，盡管目前上以及我國有了部分標準血清或參比血清（血清盤）。但由于受方法學及技術(shù)條件的限制，在酶聯(lián)吸附測定中有時不可避免的會出現(xiàn)一定的非特異性，但我們可以通過以上措施把非特異性顯色降至zui低限底，從而提高檢測的特異性，并得到更準確、可靠的實驗結(jié)果。
1、試劑盒特異性因素
1、1 固相載體的選擇。ELISA中常用的固相載體有微量滴定板、小珠和小試管三種，以微量滴定板zui為常見[1]。它具有良好的吸附性能，孔底透明度高，空白值低，各板之間、同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別，各產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大。因此，在選擇試劑盒同時要對其使用的微孔板型號進行認證，評估。
1、2包被物的純度。在酶聯(lián)免疫測定尤其是間接ELISA中，試劑的特異性取決于使用抗原的純度。目前由于技術(shù)條件的限制，包被用抗原或抗體的純度不可能達到100%，所以有些非特異性顯色不可避免，只能盡可能提高純度，提高特異性。目前使用的包被抗原一般為合成多肽抗原。
1、3包被抗體的效價。具有高親和力和高特異性的包被抗體，是決定試劑特異性的重要方面。
1、4 封閉。是ELISA中重要的一步，目的是封閉固相載體表面尚未被所占據(jù)的空隙[2]，減少后續(xù)步驟中非特異性蛋白的干擾。
2、檢驗標本中含有酶標記物的干擾物
2、1內(nèi)源性干擾物：類風濕因子（RF）、黃疸等，類風濕因子是可作用于多種動物以及人IgGFc段的自身抗體，多數(shù)為IgM類，能充當抗原成分與固相及酶標抗體反應，從而呈現(xiàn)非特異性顯色。
黃疸血標本中常含有內(nèi)源性過氧化物酶，如用辣根過氧化物酶為標記物，就有可能產(chǎn)生非特異性顯色。
2、2 外源性干擾物，常常因樣品采集、貯存、處理不當造成如樣品溶血，被細菌污染，標本凝集不全等。溶血標本，紅細胞溶解破裂，釋放出血紅素形成，而血紅素中的鐵卟啉是過氧化物酶的類似物，以HRP為標記的ELISA測定中，溶血標本可能會增加非特異性顯色。如有細菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP（辣根過氧化酶）[2]，有國內(nèi)報道酶免HBsAg試劑檢測溶血標本時可造成假陽性[3]。如在冰箱中保存過久，其中的IgG可發(fā)生聚合，在間接法ELISA中可使本底加深[2]。因此，血標本在采集處理時應小心，在冰箱中保存不易過久。
標本凝集不全時，血清中會殘留部分纖維蛋白原，也易造成假陽性。
3、操作過程中的問題造成假陽性
3、1加樣
對于間接ELISA標本一般都要進行稀釋，如果加樣不準就會造成誤差，尤其當稀釋倍數(shù)大時，很小的誤差，會導致較大的相對誤差，使陰性（或弱陽性）標本呈陽性（或陰性）。加樣時應將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。目前，大部分血站都已使用全自動酶免加樣系統(tǒng)處理標本，可較好地避免以上誤差。
3、2洗滌
在ELISA中正確的洗滌是保證得到可重復結(jié)果的關(guān)健一步，應引起操作者重視。無論是手工操作還是機器操作，得出不正確的結(jié)果常與不正確的洗滌有關(guān)，ELISA就是靠洗滌來達到分離游離和結(jié)合的酶標記物的目的。通過洗滌以消除殘留在板孔中沒能與固體抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。
3、3 溫育
每種試劑都有其*反應模式，其中溫度和溫育時間控制是重要因素。因孵育溫度高，反應時間長，會造成整板本底高，陽性率高。溫育一般用濕盒或水浴，反應板不宜疊放，以保證各板溫度都能迅速平衡，為避免蒸發(fā)，板上應加蓋。
3、4酶標儀判讀
作為記錄測定結(jié)果的儀器，酶標儀的性能穩(wěn)定與否，決定結(jié)果的可靠度。首先酶標儀應定期進行保養(yǎng)，對濾光片要定期校正；其次酶標儀波長設(shè)置要正確，使用雙波長，一個檢測波長，一個參比波長，以消除微孔板底部劃痕、不平、指印或液面高度差異造成的光干擾。此外，在用酶標儀讀數(shù)時先擦試微孔板底部并壓平板條。由于各種酶標儀性能有所不同，使用中應詳細閱讀說明書
綜上所述，由于酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)目前在技術(shù)上缺乏標準化，盡管目前上以及我國有了部分標準血清或參比血清（血清盤）。但由于受方法學及技術(shù)條件的限制，在酶聯(lián)吸附測定中有時不可避免的會出現(xiàn)一定的非特異性，但我們可以通過以上措施把非特異性顯色降至zui低限底，從而提高檢測的特異性，并得到更準確、可靠的實驗結(jié)果。