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提取細胞質(zhì)和細胞核蛋白的操作步驟
點擊次數(shù):7063 發(fā)布時間:2020-5-8
在細胞實驗中提取細胞質(zhì)和細胞核蛋白的操作步驟:
1.決定細胞生長狀態(tài),細胞生長狀態(tài)應該是80%或者更好;
2.用離心機以1500r/min離心5min;
3.棄上清液,用等體積的冷PBS洗細胞,像步驟2那樣,反復3次;
4.根據(jù)估計的沉淀量加入5倍體積的isotonic lysis buffer到細胞顆粒中,使細胞溫和懸浮,盡量避免泡沫;
5.加入裂解液lysis buffer在懸浮的細胞中,并放在冰上15min讓細胞膨脹,可以通過顯微鏡檢查;
6.對于細胞實驗中膨脹的細胞,加入10%的IGEPAL CA-630使*后的濃度達到0.3%,混勻,加的時候要溫和;
7. 立即離心(量大的可以用1.5mlde EP管,以5500r/min離心30s;量大的可以用50ml的管子以5500r/min離心2min);
8.轉移上清液(細胞質(zhì)蛋白)到一個新的冷凍管中;
9.用懸浮顆粒5倍體積的isotonic lysis buffer懸浮細胞,并混勻;
10.用離心機離心細胞懸浮液,以1500r/min離心5min,移掉上清液;
11.用2/3倍體積的extraction buffer懸浮顆粒;
12.把管子放置在震蕩混勻器上,以700r/min,15min震蕩混勻,接著以1400r/min,15min,整個過程要仔細,避免泡沫產(chǎn)生;
13.以9400r/min離心15min,離心完后轉移上清液到一個新的冷凍離心管中;
14.分成幾份用液氮冷凍,并且保存起來(長期保存應放在-80℃上,短期保存要放在-20℃上)。