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細(xì)胞常見(jiàn)技術(shù)問(wèn)題與解答
點(diǎn)擊次數(shù):2486 發(fā)布時(shí)間:2019-4-4
上海嶸崴達(dá)公司專業(yè)提供細(xì)胞培養(yǎng)液,DMEM,IMEM,DMEM/Han's F-12,L-15,BME,MEM 199,RPMI 1640,AME'S,Fischer's Medium,McCoy's,TC-100,細(xì)胞生長(zhǎng)因子,血清等。
細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)常見(jiàn)問(wèn)題解答
一、細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)問(wèn)答
1.BHK細(xì)胞就是指BHK21嗎?
答:BHK細(xì)胞是指幼年敘利亞地鼠腎細(xì)胞(Baby Hamster Syrian Kidney),1961年建株。原始的細(xì)胞株是成纖維細(xì)胞,貼壁依賴性。1963年獲得單細(xì)胞克隆細(xì)胞。后經(jīng)無(wú)數(shù)次傳代后細(xì)胞可懸浮生長(zhǎng),它廣泛用于增殖各種病毒,生產(chǎn)獸用疫苗。zui常用的是BHK21的一個(gè)亞克隆細(xì)胞,即克隆13或C13 。
2.二倍體細(xì)胞有什么特點(diǎn)?
答:二倍體細(xì)胞的染色體組型是2n核型;貼壁依賴接觸抑制;一般可傳代50代;無(wú)致瘤性。如W1-38:正常胚肺組織人二倍體細(xì)胞系。MRC-5:從正常男性肺組織中獲得的人二倍體細(xì)胞系。
3.什么是動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)?
答:所謂動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)(large-scale culture technology)是指在人工條件下(設(shè)定pH、溫度、溶氧等),在細(xì)胞生物反應(yīng)器(bioreactor)中高密度大量培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞用于生產(chǎn)生物制品的技術(shù)。目前可大規(guī)模培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞有雞胚、豬腎、猴腎、地鼠腎等多種原代細(xì)胞及人二倍體細(xì)胞、CHO(中華倉(cāng)鼠卵巢)細(xì)胞、BHK-21、Vero細(xì)胞(非洲綠猴腎傳代細(xì)胞)等,并已成功生產(chǎn)了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、紅細(xì)胞生成素、單克隆抗體等產(chǎn)品。
在過(guò)去幾十年來(lái),細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)經(jīng)有了很大發(fā)展,從使用轉(zhuǎn)瓶(roller bottle) 、CellCube等貼壁細(xì)胞培養(yǎng),發(fā)展為生物反應(yīng)器(Bioreactor)進(jìn)行大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)。
4.細(xì)胞體內(nèi)外培養(yǎng)的差別是什么?
答:細(xì)胞離體后,失去了神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞間的相互影響,生活在缺乏動(dòng)態(tài)平衡相對(duì)穩(wěn)定環(huán)境中,日久天長(zhǎng),易發(fā)生如下變化:分化現(xiàn)象減弱;形態(tài)功能趨于單一化或生存一定時(shí)間后衰退死亡;或發(fā)生轉(zhuǎn)化獲得不死性,變成可無(wú)限生長(zhǎng)的連續(xù)細(xì)胞系或惡性細(xì)胞系。因此,培養(yǎng)中的細(xì)胞可視為一種在特定的條件下的細(xì)胞群體,它們既保持著與體內(nèi)細(xì)胞相同的基本結(jié)構(gòu)和功能,也有一些不同于體內(nèi)細(xì)胞的性狀。實(shí)際上從細(xì)胞一旦被置于體外培養(yǎng)后,這種差異就開(kāi)始發(fā)生了。
5.什么是無(wú)血清培養(yǎng)基?與普通培養(yǎng)基有什么區(qū)別?
答:無(wú)血清培養(yǎng)基(serum free medium,SFM):是不需要添加血清就可以維持細(xì)胞在體外較長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng)繁殖的合成培養(yǎng)基。但是它們可能包含個(gè)別蛋白或大量蛋白組分。基本成分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基及添加組分兩大部分。添加組分可能包括纖連蛋白、層粘連蛋白等貼壁因子、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、硒等。
6.什么是無(wú)血清無(wú)動(dòng)物組分培養(yǎng)基、無(wú)蛋白培養(yǎng)基和限定化學(xué)成分培養(yǎng)基?
答:無(wú)血清無(wú)動(dòng)物組分培養(yǎng)基是不含任何動(dòng)物來(lái)源成份的無(wú)血清培養(yǎng)基,但可能添加植物蛋白或重組蛋白。無(wú)蛋白培養(yǎng)基(protein free midium,PFM):即不含有蛋白的培養(yǎng)基,無(wú)論是植物蛋白或動(dòng)物蛋白。成分培養(yǎng)基(chemical defined medium,CDM):是指培養(yǎng)基中的素有成分都是明確的,它同樣不含有蛋白,也不是添加了植物水解物,而是使用了一些已知結(jié)構(gòu)與功能的小分子化合物,如短肽等。這種培養(yǎng)基更有利于分析細(xì)胞的分泌產(chǎn)物和產(chǎn)品純化。
7.HEPES在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中起什么作用?
答:HEPES溶液:是一種弱酸,中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸,主要作用是防止培養(yǎng)基pH迅速變動(dòng)。在開(kāi)放式培養(yǎng)條件下,觀察細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)基脫離了5%CO2的環(huán)境,CO2氣體迅速逸出,pH迅速升高,若加了HEPES,此時(shí)可以維持pH7.0左右。一般在進(jìn)行克隆化培養(yǎng)時(shí)要添加HEPES。
8.CO2 培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔?
答:定期(至少每?jī)芍芤淮?/span>) 以無(wú)菌蒸餾水或無(wú)菌去離子水更換之。
二、 培養(yǎng)基生產(chǎn)和使用常見(jiàn)問(wèn)題
1.低血清培養(yǎng)基能用肉眼判斷其pH值嗎?
答:低血清培養(yǎng)基中酚紅的含量與普通培養(yǎng)基中的酚紅含量不同,不能通過(guò)肉眼觀察或通過(guò)經(jīng)驗(yàn)來(lái)判定pH值,建議使用pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定。
2.低血清培養(yǎng)基的緩沖系統(tǒng)是什么?
答:平衡鹽一般是由無(wú)機(jī)鹽及葡萄糖組成的。平衡鹽有Hanks′系統(tǒng)、Earle′s系統(tǒng)、Dulbecco′s磷酸緩沖鹽系統(tǒng)等。199系列培養(yǎng)基、MEM系列培養(yǎng)基均有Hanks′系統(tǒng)的培養(yǎng)基及Earle′s系統(tǒng)的培養(yǎng)基。但是有些培養(yǎng)基均不是以上常規(guī)的平衡鹽系統(tǒng),例如RPMI 1640培養(yǎng)基、F12培養(yǎng)基。MEM(SLM)低血清培養(yǎng)基的平衡鹽系統(tǒng)也不是常規(guī)的平衡鹽系統(tǒng),該平衡鹽系統(tǒng)的緩沖能力強(qiáng)于常規(guī)平衡鹽系統(tǒng)的緩沖能力。
3.谷氨酰胺溶液和碳酸氫鈉的配制方法是什么?
答:以0.2mol/L的 L-谷氨酰胺配制為例:稱取L-谷氨酰胺2.92g,加注射用水100ml,充分?jǐn)嚢杌靹?/span>。用0.2μm濾膜正壓過(guò)濾除菌。溶液應(yīng)在4℃下避光保存,2周內(nèi)使用。以7.5% NaHCO3的配制為例:稱取NaHCO37.5g溶于100ml蒸餾水中過(guò)濾除菌。
4.什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅?
答:酚紅在培養(yǎng)基中用作pH值的指示劑:中性時(shí)為紅色,酸性時(shí)為黃色,堿性時(shí)為紫色。酚紅本身對(duì)生物制品質(zhì)量并不會(huì)產(chǎn)生影響,可以通過(guò)純化技術(shù)去除,但酚紅在無(wú)血清培養(yǎng)基可能帶來(lái)胞內(nèi)鈉/鉀失衡,影響細(xì)胞生長(zhǎng),當(dāng)然這種作用能被血清所中和或減輕。酚紅并不是培養(yǎng)基中必需的一種成分,很多國(guó)外的疫苗或抗體生產(chǎn)企業(yè)在生產(chǎn)過(guò)程中都使用無(wú)酚紅培養(yǎng)基。
5.放置在冰箱中的培養(yǎng)基顏色會(huì)發(fā)生變化,為什么?
答:培養(yǎng)基保存于4℃冰箱中,培養(yǎng)基內(nèi)CO2 會(huì)逐漸溢出,造成培養(yǎng)基越來(lái)越偏堿性。而培養(yǎng)基中酸堿指示劑(通常為phenol red)的顏色也會(huì)隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿后再用于細(xì)胞培養(yǎng)將造成細(xì)胞生長(zhǎng)停滯或死亡。培養(yǎng)基偏堿時(shí),可以通入無(wú)菌過(guò)濾的CO2,以調(diào)整pH值。
6.無(wú)血清培養(yǎng)與有血清培養(yǎng)使用的抗生素量一樣嗎?
答:當(dāng)在無(wú)血清培養(yǎng)基中添加抗生素時(shí),降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的50%。因?yàn)檠逯械牡鞍讜?huì)結(jié)合和滅活一些抗生素。而在無(wú)血清培養(yǎng)條件下,抗生素不被滅活。
7.培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素后,可長(zhǎng)期保存嗎?
答:一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時(shí),您應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用它。因?yàn)橐恍┛股睾脱逯械幕境煞衷诮鈨龊缶烷_(kāi)始降解。
8.什么是個(gè)性化培養(yǎng)基?它有什么優(yōu)點(diǎn)?
答:根據(jù)細(xì)胞類型、培養(yǎng)方式和生產(chǎn)工藝等特點(diǎn)所定制的培養(yǎng)基,即個(gè)性化培養(yǎng)基。個(gè)性化培養(yǎng)基在國(guó)外生物制藥企業(yè)被普遍采用,個(gè)性化培養(yǎng)基可以為細(xì)胞生長(zhǎng)提供充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),能提高細(xì)胞的生長(zhǎng)速率、培養(yǎng)密度、以及延長(zhǎng)細(xì)胞維持時(shí)間;也可以為細(xì)胞生長(zhǎng)提供均衡的營(yíng)養(yǎng)供給,減少細(xì)胞有害代謝物質(zhì)的積累,降低對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的危害;同時(shí)對(duì)貼壁細(xì)胞而言,能增加細(xì)胞的貼壁性,并降低培養(yǎng)過(guò)程中剪切力對(duì)細(xì)胞的損傷;個(gè)性化培養(yǎng)基可以根據(jù)各戶的特殊需求減少或不使用動(dòng)物源成分,從而使生物制品安全性更有保障。
9.細(xì)胞培養(yǎng)基偶然被凍,可否繼續(xù)使用?
答:如果細(xì)胞培養(yǎng)基偶然被凍,您應(yīng)該自然溶解培養(yǎng)基并觀察是否有沉淀產(chǎn)生。如果沒(méi)有沉淀產(chǎn)生,培養(yǎng)基可以正常使用,如果出現(xiàn)沉淀,只能丟棄這些培養(yǎng)基。
10.細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何?
答:動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存時(shí)zui常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5 - 10%DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95%原來(lái)細(xì)胞生長(zhǎng)用的新鮮培養(yǎng)基均勻混合。注意:由于DMSO稀釋時(shí)會(huì)放出大量熱能,故不可將DMSO直接加入細(xì)胞液中,必須使用前先行配制完成。
11.培養(yǎng)基及其它添加物和試劑可反復(fù)凍融嗎?
答:大部分添加物和試劑zui多可以凍融3次,如果次數(shù)過(guò)多會(huì)將使含有的蛋發(fā)生降解和沉淀,這將會(huì)影響它的性能。
12.液體培養(yǎng)基的保存是冷藏好?還是冷凍好?
答:要冷藏?。?/span>通常液體培養(yǎng)基在冷藏條件下可存放6個(gè)月到一年。
三、常見(jiàn)血清使用問(wèn)題
1.血清使用時(shí)一定需要滅活么?
答:實(shí)驗(yàn)顯示,經(jīng)過(guò)正確處理的熱滅活血清對(duì)大多數(shù)的細(xì)胞而言是不需要的。經(jīng)此處理過(guò)的血清對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)只有微小的促進(jìn),或*沒(méi)有任何作用,甚至因?yàn)楦邷靥幚碛绊懥搜宓馁|(zhì)量,而造成細(xì)胞生長(zhǎng)速率的降低。而經(jīng)過(guò)熱處理的血清,沉淀物的形成會(huì)顯著的增多,這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察,像是“小黑點(diǎn)”,常常會(huì)讓研究者誤以為是血清遭受污染,而把血清放在37℃環(huán)境中,又會(huì)使此沉淀物更增多,使研究者誤認(rèn)為是微生物的分裂擴(kuò)增。若非必須,可以不需要做熱處理這一步。不但節(jié)省時(shí)間,更確保血清的質(zhì)量。
2.何謂FBS, FCS, CS, HS?
答:FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思, 兩者都是指胎牛血清, FCS 乃錯(cuò)誤的使用字眼, 請(qǐng)不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。
3.保存血清zui好的方法是什么?
答:我們建議血清應(yīng)保存在-5℃至-2O℃。若存放于4℃時(shí),請(qǐng)勿超過(guò)一個(gè)月。若一次無(wú)法用完一瓶,建議無(wú)菌分裝血清至恰當(dāng)?shù)臏缇萜鲀?nèi),再放回冷凍。
4.如何解凍血清才不會(huì)使產(chǎn)品質(zhì)量受損?
答:將血清從冷凍箱取出后,先置于2~8℃冰箱使之融解,然后在室溫下使之全融。但必須注意的是,融解過(guò)程中必須規(guī)則地?fù)u晃均勻。
5.血清解凍后發(fā)現(xiàn)有絮狀沉淀物出現(xiàn),該如何處理?
答:血清中沉淀物的出現(xiàn)有許多種原因,但zui普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成,而血纖維蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解凍后,也會(huì)存在于血清中,亦是造成沉淀物的原因之一。但這些絮狀沉淀物,并不影響血清本身的質(zhì)量。若欲去除這些絮狀沉淀物,可以將血清分裝至無(wú)菌離心管內(nèi),以400g稍微離心,上清液即可接著加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過(guò)濾。zui好不使用過(guò)濾的方法去除這些絮狀沉淀物,因?yàn)樗赡軙?huì)阻塞過(guò)濾膜。
6.如何避免血清中沉淀物的產(chǎn)生?
答: (1)解凍血清時(shí),請(qǐng)按照所建議的逐步解凍法(-20℃至4℃至室溫),若血清解凍時(shí)改變的溫度太大(如-20℃至37℃),非常容易產(chǎn)生沉淀物。
(2)解凍血清時(shí),請(qǐng)隨時(shí)將之搖晃均勻,使溫度及成分均一,減少沉淀的發(fā)生。
(3)請(qǐng)勿將血清置于37℃太久。若在37℃放置太久,血清會(huì)變得混濁,同時(shí)血清中許多較不穩(wěn)定的成分會(huì)因此受到損害,而影響血清的質(zhì)量。
(4)血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多,若非必要,可以無(wú)須做此步驟。
(5)若必須做血清的熱滅活,請(qǐng)遵守56℃,30分鐘的原則,并且隨時(shí)搖晃均勻。溫度過(guò)高,時(shí)間過(guò)久或搖晃不均勻,都會(huì)造成沉淀物的增多。
四、細(xì)胞培養(yǎng)常用試劑使用問(wèn)答
1.谷氨酰胺使用方法是什么?
答:谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定,故4℃下放置1周可分解50%,使用中zui好單獨(dú)配制,置-20℃冰箱中保存,用前加入培養(yǎng)液中。
2.碳酸氫鈉在室溫條件存放是否穩(wěn)定?
答:碳酸氫鈉白色粉末,或不透明單斜晶系細(xì)微結(jié)晶。比重2.159。無(wú)臭、味咸,可溶于水,微溶于乙醇。其水溶液因水解而呈微堿性,受熱易分解,在65℃以上迅速分解,在270℃時(shí)*失去二氧化碳,在干燥空氣中無(wú)變化,在潮濕空氣中緩慢分解。
3.培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)減慢的原因有哪些?其解決辦法有哪些?
答:可能得原因有:更換了不同的培養(yǎng)液或血清;培養(yǎng)液中一些細(xì)胞生長(zhǎng)必需成分如谷氨酰胺或生長(zhǎng)因子等耗盡或缺乏或已被破壞;培養(yǎng)物中有少量細(xì)菌或真菌污染;試劑保存不當(dāng);比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分,比較新血清與舊血清支持細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)找出可能的原因。
解決辦法:增加起始培養(yǎng)細(xì)胞濃度;讓細(xì)胞逐漸適應(yīng)新培養(yǎng)液;換入新鮮配制培養(yǎng)液;補(bǔ)加谷氨酰胺或生長(zhǎng)因子等;用無(wú)抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng),如發(fā)現(xiàn)污染,丟棄培養(yǎng)物,或用抗生素除菌;血清需保存在-5℃到-20℃;培養(yǎng)液需在2-8℃避光保存;含血清*培養(yǎng)液在2-8℃保存,并在2 周內(nèi)用完;分離培養(yǎng)物,檢測(cè)支原體。
4.L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎?它在溶液中不穩(wěn)定嗎?
答:L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)非常重要的。脫掉氨基后,L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來(lái)源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后會(huì)降解,降解率隨保存溫度而變。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成,而氨對(duì)于一些細(xì)胞具有毒性。
5.細(xì)胞傳代消化時(shí)所用胰酶濃度越高越好嗎?
答:不見(jiàn)得!因?yàn)橐鹊鞍酌溉芤旱南芰κ呛腿芤旱?/span>pH、溫度、胰酶濃度及溶液中是否含有Ca++, Mg++離子和血清等因素有關(guān)。通常情況下,pH 8.0 , 溫度 37 oC 其作用能力zui強(qiáng)。另外,鈣、鎂離子及血清均能大大降低其消化能力。我們每次進(jìn)行傳代消化前,一定要用D-Hanks液或PBS液反復(fù)沖洗細(xì)胞培養(yǎng)瓶,以便于將含血清的培養(yǎng)基沖洗干凈,這樣就能大大提高消化液的消化能力。通常使用的消化液濃度為:
(1)0.05%胰蛋白酶+0.02%EDTA;
(2)0.25% 胰蛋白酶
多數(shù)細(xì)胞傳代消化可使用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA這種消化液。
6.二價(jià)離子抑制胰蛋白酶活性嗎?使用胰蛋白酶時(shí)加入EDTA的目的是什么?
答:二價(jià)離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來(lái)螯合游離的鎂離子和鈣離子,以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細(xì)胞前,用EDTA清洗細(xì)胞,以消除來(lái)自培養(yǎng)基中所有的二價(jià)離子。
7.GlutaMAX-I是什么?培養(yǎng)細(xì)胞如何利用GlutaMAX-I?這個(gè)二肽有多穩(wěn)定?
答:GlutaMAX-I 即谷丙氨酸二肽,是一個(gè)L-谷氨酰胺的衍生物,其不穩(wěn)定的alpha-氨基用L-丙氨酸來(lái)保護(hù)。一種肽酶逐漸裂解二肽,釋放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定,即使在121磅滅菌20分鐘,GlutaMAX-I 二肽溶液有zui小的降解,如果在相同條件下,L-谷氨酰胺幾乎*降解
8.培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么?
答:丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源,盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源,但是,如果沒(méi)有葡萄糖的話,細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉。
9.Hank′s 平衡鹽溶液(HBS)和Earle′s平衡鹽溶液(EBS)有什么本質(zhì)的功能差別?
答:HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在Eagle′s (2.2g/L)中比在Hanks′ (0.35g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡,以維持溶液的PH值。Eagle′s液在空氣水平的CO2 中,溶液會(huì)變堿,Hanks′液在CO2培養(yǎng)箱中會(huì)變酸。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織,需要用Eagle′s液。如果僅僅是清洗將要在細(xì)胞培養(yǎng)基中儲(chǔ)存的組織,用Hanks′液就可以了。
五、細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程常見(jiàn)問(wèn)題
1.為什么培養(yǎng)的細(xì)胞要及時(shí)傳代?
答:體外培養(yǎng)的細(xì)胞大多具有生長(zhǎng)接觸抑制的特性,也就是說(shuō)當(dāng)一個(gè)細(xì)胞被其他細(xì)胞包圍的時(shí)候,它就會(huì)停止生長(zhǎng),及時(shí)傳代后,細(xì)胞的生長(zhǎng)得以繼續(xù)。
2.培養(yǎng)液pH下降很快可能原因有哪些?其解決辦法是什么?
答:通常細(xì)胞生長(zhǎng)得非常快時(shí),pH值通常下降得很快。此時(shí)可以及時(shí)傳代、提高傳代比例或降低血清量等方法進(jìn)行解決。此外,培養(yǎng)瓶蓋擰得太緊、NaHCO3 緩沖系統(tǒng)緩沖能力不夠、培養(yǎng)液中鹽濃度不正確、細(xì)菌、酵母或真菌污染等也能導(dǎo)致pH值通常下降得很快。
(1)按培養(yǎng)液中NaHCO3 濃度增加或減少培養(yǎng)箱內(nèi)CO2 濃度,2.0g/L 到3.7g/L 濃度NaHCO3對(duì)應(yīng)CO2濃度為5%到10%。
(2)改用不依賴CO2培養(yǎng)液。
(3)松開(kāi)瓶蓋1/4 圈。加HEPES 緩沖液至10 到25mM終濃度。
(4)在CO2 培養(yǎng)環(huán)境中改用基于Earle′s 鹽配制的培養(yǎng)液,在大氣培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)改用Hanks 鹽配制的培養(yǎng)液。
(5)如果是污染造成的則丟棄培養(yǎng)物或用抗生素除菌。
3.培養(yǎng)液pH對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響?
答:由于大多數(shù)細(xì)胞適宜pH為7.2-7.4,偏離此范圍可能對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)將產(chǎn)生有害的影響。但各種細(xì)胞對(duì)pH的要求也不*相同,原代培養(yǎng)細(xì)胞一般對(duì)pH變動(dòng)耐受差,無(wú)限細(xì)胞系耐受力強(qiáng)。但總體來(lái)說(shuō),細(xì)胞耐酸性比耐堿性強(qiáng)一些。在配制培養(yǎng)用液時(shí),需要注意一點(diǎn):培新配的培養(yǎng)基在經(jīng)過(guò)0.10um或0.22um濾膜過(guò)濾時(shí),溶液的pH還會(huì)向上浮動(dòng)0.2左右。
4.購(gòu)買之細(xì)胞冷凍管經(jīng)解凍后,為何會(huì)發(fā)生細(xì)胞數(shù)目太少之情形?
答:研究人員在冷凍細(xì)胞之培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目太少,大都是因?yàn)殡x心過(guò)程操作上的失誤,造成細(xì)胞的物理性損傷,以及細(xì)胞流失。建議細(xì)胞解凍后不要立刻離心,應(yīng)待細(xì)胞生長(zhǎng)隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。但對(duì)于DMSO敏感的細(xì)胞,還是復(fù)蘇細(xì)胞時(shí),用離心去除DMSO比較好。
5.購(gòu)買之細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活率不佳可能原因?
答:研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)存活率不佳,原因比較復(fù)雜,常見(jiàn)原因可歸納為:培養(yǎng)基使用錯(cuò)誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳;血清使用錯(cuò)誤或血清的品質(zhì)不佳;解凍過(guò)程錯(cuò)誤;冷凍細(xì)胞解凍后,加以洗滌細(xì)胞和離心;懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞;培養(yǎng)溫度使用錯(cuò)誤;細(xì)胞置于–80 ℃太久等。建議嚴(yán)格參照ATCC或ECACC的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇、凍存等工作。
6.支原體污染會(huì)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有何影響?
答:支原體污染幾乎可影響所有細(xì)胞之生長(zhǎng)參數(shù)、代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前,必須確認(rèn)細(xì)胞為mycoplasma-free,實(shí)驗(yàn)結(jié)果之?dāng)?shù)據(jù)方有意義。
7.冷凍保存細(xì)胞之方法?
答:冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃(30-60 分鐘)→-20℃( 30 分鐘) → -80℃(16-18 小時(shí)或隔夜)→ 液氮罐長(zhǎng)期儲(chǔ)存。
冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機(jī)中每分鐘降1-3℃至–80 ℃以下, 再放入液氮中長(zhǎng)期儲(chǔ)存。注意:-20℃不可超過(guò)1 小時(shí),以防止冰晶過(guò)大,造成細(xì)胞大量死亡,亦可跳過(guò)此步驟直接放入-80℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。
8.懸浮細(xì)胞應(yīng)如何繼代處理?
答:一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)瓶中,稀釋細(xì)胞濃度即可。若培養(yǎng)液太多時(shí)可分瓶取出一部份含細(xì)胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)瓶中,加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度,重復(fù)前述步驟即可。
9.欲將一般動(dòng)物細(xì)胞離心下來(lái),其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速?
答:欲回收動(dòng)物細(xì)胞,其離心速率一般為300×g (約1,000rpm),5 - 10 分鐘,過(guò)高之轉(zhuǎn)速過(guò)長(zhǎng)時(shí)間都將造成細(xì)胞死亡。合適的離心轉(zhuǎn)速是根據(jù)相對(duì)離心決定。 RCF=1.119×105×r×(rpm)2,其中 r為離心機(jī)轉(zhuǎn)軸中心與離心套管底部?jī)?nèi)壁的距離;rpm為離心機(jī)每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù);RCF(relative eentrifugal force)為相對(duì)離心力,以重力加速度g(980.66cm/s2)的倍數(shù)來(lái)表示表示單位。
10.培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)使用5%還是10%CO2,或者根本沒(méi)有影響?
答:一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統(tǒng), 而培養(yǎng)基中NaHCO3的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用的CO2濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 含量為每公升3.7g時(shí),細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用10% CO2;當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3為每公升1.5g時(shí),則應(yīng)使用5%CO2培養(yǎng)細(xì)胞。
11.細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時(shí),是否應(yīng)馬上去除DMSO?
答:除少數(shù)特別注明對(duì)DMSO敏感之細(xì)胞外,絕大部分細(xì)胞株(包括懸浮性細(xì)胞),在解凍之后,應(yīng)直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)方瓶中,待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO即可,如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)或貼附之問(wèn)題。
12.冷凍管應(yīng)如何解凍?
答:取出冷凍管后,須立即放入37℃水槽中快速解凍,輕搖冷凍管使其在1-2 分鐘內(nèi)大部分融化,特別注意,需殘留一小塊冰塊,就可拿到超凈工作臺(tái)操作細(xì)胞,用75%消毒凍存管,用新鮮培養(yǎng)基將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶。另外冷凍管由液氮桶中取出解凍時(shí),必須注意安全,預(yù)防冷凍管之爆裂。
13.如何用臺(tái)盼蘭計(jì)數(shù)活細(xì)胞?
答:將樣品適當(dāng)稀釋后,用稀釋后的樣品和0.4%的臺(tái)盼蘭溶液按1:1混合后,用移液槍點(diǎn)樣到血球計(jì)數(shù)板,置于倒置顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù),其中藍(lán)色細(xì)胞是死細(xì)胞,因活細(xì)胞排斥臺(tái)盼蘭,不被染色。
14.細(xì)胞欲冷凍保存時(shí),細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度?
答:冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為1-8×106 cells/ml vial。
15.細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何?
答:動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存時(shí)zui常使用的冷凍培養(yǎng)基是含9 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原來(lái)細(xì)胞生長(zhǎng)用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意:由于DMSO 稀釋時(shí)會(huì)放出大量熱能,故不可將DMSO 直接加入細(xì)胞液中,必須使用前先行配制完成。
16.如何消除組織培養(yǎng)的污染?
答:當(dāng)重要的培養(yǎng)細(xì)胞污染時(shí),研究者可能試圖消除或控制污染。首先,確定污染物是細(xì)菌、真菌、支原體或酵母,把污染細(xì)胞與其它細(xì)胞系隔離開(kāi),用實(shí)驗(yàn)室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺(tái),檢查HEPA過(guò)濾器。
高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對(duì)一些細(xì)胞系有毒性,因而,做劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點(diǎn)在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂(lè)菌素時(shí)尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實(shí)驗(yàn)步驟。
1)在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中消化、計(jì)數(shù)和稀釋細(xì)胞,稀釋到常規(guī)細(xì)胞傳代的濃度。
2)分散細(xì)胞懸液到多孔培養(yǎng)板中,或幾個(gè)小培養(yǎng)瓶中。在一個(gè)濃度梯度范圍內(nèi),把選擇抗生素加入到每一個(gè)孔中。例如,兩性霉素B推薦下列濃度,0.25,0.50,1.0,2.0,4.0,8.0 mg/ml。
3)每天觀測(cè)細(xì)胞毒性指標(biāo),如脫落,出現(xiàn)空泡,匯合度下降和變圓。
4)確定抗生素毒性水平后,使用低于毒性濃度2-3倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞2-3代。
5)在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞一代。
6)重復(fù)步驟4。
7)在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-6代,確定污染是否以已被消除。
17.培養(yǎng)細(xì)胞出現(xiàn)死亡其可能的原因有什么?解決辦法有哪些?
答:可能的原因有培養(yǎng)箱內(nèi)無(wú)CO2;培養(yǎng)箱內(nèi)溫度波動(dòng)太大;細(xì)胞凍存或復(fù)蘇過(guò)程中損傷;培養(yǎng)液滲透壓不正確;培養(yǎng)液種有毒代謝產(chǎn)物堆積等。解決辦法可以檢測(cè)培養(yǎng)箱內(nèi)CO2濃度,檢查培養(yǎng)箱內(nèi)溫度;取新的保存細(xì)胞種;檢測(cè)培養(yǎng)液滲透壓等;換入新鮮培養(yǎng)液等。
18.國(guó)內(nèi)可以買到細(xì)胞株的地方有哪些?
答:可以從國(guó)內(nèi)多家代理廠家買到ATCC或ECACC的細(xì)胞株,同時(shí)國(guó)內(nèi)可以買到細(xì)胞株的地方還有中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院(協(xié)和醫(yī)科大學(xué))基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部,中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞研究所以及武漢大學(xué)冷藏中心等。
19.細(xì)胞的滲透壓耐受性是多少?
答:細(xì)胞必須生活在等滲環(huán)境中,大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)滲透壓有一定耐受性。人血漿滲透壓290mOsm/kg, 可視為培養(yǎng)人體細(xì)胞的理想滲透壓。鼠細(xì)胞滲透壓在320mOsm/kg左右。對(duì)于大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞,滲透壓在260-320mOsm/kg的范圍都適宜。
20.支原體(mycoplasma) 污染的細(xì)胞,是否能以肉眼觀察出異狀?
答:不能。除極有經(jīng)驗(yàn)之專家外,大多數(shù)遭受支原體污染的細(xì)胞株,無(wú)法以其外觀分辨之。
21.怎樣查到一個(gè)特定細(xì)胞株的相關(guān)知識(shí)和培養(yǎng)條件?
答:ATCC (American Type Culture Collection) 收集了絕大多數(shù)細(xì)胞的詳細(xì)資料。打開(kāi)ATCC網(wǎng)頁(yè)的Cells and hybridomas鏈接,輸入細(xì)胞名稱就可以搜索ATCC的細(xì)胞數(shù)據(jù)庫(kù)。數(shù)據(jù)庫(kù)中有每一種細(xì)胞的詳細(xì)描述,包括細(xì)胞的來(lái)源,培養(yǎng)和凍存條件,以及相關(guān)文獻(xiàn)等資料。
22.為什么要在溶解的一周內(nèi)使用貯存在4℃冰箱中的液體胰蛋白酶溶液?
答:胰蛋白酶在4℃就可能開(kāi)始降解,如果在室溫下放置超過(guò)30分鐘,就會(huì)變得不穩(wěn)定。