酶聯(lián)斑點(diǎn)（Elispot）實(shí)驗(yàn)服務(wù)

酶聯(lián)斑點(diǎn)(Elispot) 技術(shù)概述：

酶聯(lián)斑點(diǎn)(Elispot) 全名為酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測，英文: Enzyme-linked Immunospot Assay.它結(jié)合了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(即ELISA技術(shù))， 能夠在單細(xì)胞水平檢測細(xì)胞因子的分泌情況。其技術(shù)原理，一句話概括就是:用抗體捕獲培養(yǎng)中的細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，并以酶聯(lián)斑點(diǎn)顯色的方式將其表現(xiàn)出來。

1、實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備工作

(1)設(shè)備與耗材:

①超凈工作臺;

②5% CO2 37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱;

③P20，P200， P1000 微量移液器,

④P300 8通道微量移液器，P300 12通道微量移液器,

⑤Biosys ELISPOT Reader

⑥P20，P200， P1000 槍頭;

⑦多道移液器吸槽;

⑧0.5mL, 1.5mL EP管。

(2)溶液配制

①PBS:用分析純試劑，Millipore級別的純水配制， 高壓滅菌。

②PBST: PBS加入0.05% Tween-20,注意無菌操作。儲存于20-25°C, 可存放一個(gè)月。

③70%乙醇:分析純乙醇70mL，加入Millipore級別的純水至100mL。

④30%乙醇:分析純2醇30mL,加入Millipore級別的純水至100mL.

⑤包被抗體(coating antibody, Primary antibody): 照U-Cytech說明書，加入雙蒸水溶解。使用時(shí)，用PBS稀釋50倍，每孔50uL。

⑥封閉液:用PBS將試劑盒中的封閉存儲液(Blocking stock solution R)稀釋10倍，每孔200uL。

⑦抗體稀釋液:注意，只是用來稀釋檢測抗體和酶聯(lián)親和素。用PBS將試劑盒中的稀釋存儲液(Dilutionbuffer R)稀釋10倍

⑧檢測抗體(Biotinylated detector antibody, Secondary antibody):照U-Cytech說明書， 加入雙蒸水溶解。使用時(shí)，用抗體稀釋液稀釋100倍，每孔100uL。

⑨酶聯(lián)親和素(Streptavidin-HRP conjugate):照U-Cytech說明書，加入雙蒸水溶解。使用時(shí)，用抗體稀釋液稀釋100倍，每孔100uL。

D AEC顯色液: 照U-Cytech說明書， 用100mL 30%乙醇溶解底物緩沖液膠囊(Substrate bufercapsule),然后加入3.3mL AEC儲存液(AEC stock solution),混合均勻后10ml每支分裝，-200C保存。

使用時(shí)，解凍，每孔加入100pL.

①PHA刺激物:將儲存液(2mg/ml，Murex)分裝成20μL/EP管， -20*C長期凍存。 使用時(shí)，加入980μLU-Cytech無血清培養(yǎng)基(或者1640基本培養(yǎng)基),成為工作液(40μg/mL，10倍終濃度)，每孔加入10μL, 終濃度4μg/mL。

②U-Cytech無血清培養(yǎng)基:我們推薦無血清ELISPOT技術(shù)，它能排除血清的干擾，結(jié)果更加穩(wěn)定可靠,背景也更好。如果沒有，可以用含10%血清的1640培養(yǎng)基代替。

2、ELISPOT標(biāo)準(zhǔn)操作程序

(1)第—天: ELISPOT包被程序設(shè)計(jì)好試驗(yàn)，把每個(gè)孔要加入的內(nèi)容做成卡片，到時(shí)候就會從容很多。每孔加入15μL 70%的醇預(yù)濕30秒。

注意:

①未潤濕的PVDF膜是潔白的、不透明的，經(jīng)過乙醇潤濕之后，顏色變暗，變成半透明狀，很容易觀察二者的區(qū)別。

②加乙醇的時(shí)候，槍頭應(yīng)該靠在孔壁接近孔底的地方，注意槍頭不到刺到PVDF膜。

③有時(shí)候，加入的乙醇掛在孔壁上， 這時(shí)要蓋上板蓋，輕輕叩擊，讓乙醇順勢滑落。乙醇一 旦接觸到PVDF膜，就會在表面張力和毛細(xì)作用之下迅速浸潤整塊膜，使得膜的顏色和透明度發(fā)生變化。

④15μL 是經(jīng)過優(yōu)化的體積，它能保證剛好*浸潤整塊膜，而不會有剩余。如果加大使用量，乙醇溶液就會透過膜而積存在膜的背面,加深實(shí)驗(yàn)的背景。

⑤加入100μL去離子水洗滌三次，盡量減少乙醇的殘留。

⑥按照試劑盒的使用說明，將包被抗體儲存液稀釋在PBS緩沖液中，每孔加入50μL，4°C包被過夜。

⑦(次日)傾倒包被液，用PBS洗滌5次，后一次，在滅菌的吸水紙上扣干。

⑧加入200μL試劑盒自帶的稀釋好的封閉液，37°C封閉1小時(shí)。

⑨傾倒封閉液，無須洗滌，直接可以進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。(也可以用PBS緩沖液或者純水洗滌- -次, 拍干,封口，4°C保存，可以在4°C保存數(shù)周。)

(2)第二天:鋪細(xì)胞，加入刺激物，培養(yǎng)

①整個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置-組正對照(PHA刺激), 每一個(gè)細(xì)胞樣品(同-個(gè)捐獻(xiàn)者或者實(shí)驗(yàn)動物)要設(shè)一個(gè)負(fù)對照

(不加刺激物)，整塊板還要加一個(gè)背景負(fù)對照(不含細(xì)胞，只加培養(yǎng)基和所有的檢測試劑)。

②填好實(shí)驗(yàn)卡片，用以指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)的安排和細(xì)胞及試劑的添加。每一個(gè)細(xì)胞/刺激物的組合設(shè)置2-4個(gè)孔的重復(fù)(想要有統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義，每個(gè)細(xì)胞/刺激物設(shè)4個(gè)孔的重復(fù))。

④取出封閉好的板，準(zhǔn)備加入細(xì)胞。如果是以前做的封閉，可以加入200μL 的U-Cytech無血清培養(yǎng)基,室溫靜置10分鐘，傾倒，然后再重復(fù)- -次。

⑤按照實(shí)驗(yàn)卡片的安排，加入不同濃度的細(xì)胞，100uLwell, 細(xì)胞在孔中的分布要盡量均勻(要訣是加入

細(xì)胞之后，不要再震動或者拍擊ELISPOT板。有人認(rèn)為拍擊板子會讓細(xì)胞更分散，實(shí)際情況剛好相反)。正對照的細(xì)胞濃度為1x105/well,實(shí)驗(yàn)組的樣品細(xì)胞濃度請自行調(diào)整。

⑥加入100μL的U-Cytech無血清培養(yǎng)基到背景負(fù)對照孔。

⑦正對照孔加入10μL PHA,終濃度4ug/mL,該濃度能有效刺激IFN-V的分泌。

⑧加入實(shí)驗(yàn)者自己的刺激物(配制成10X終濃度，10uLwell)到實(shí)驗(yàn)孔。 加完刺激物之后不要再拍擊ELISPOT板。有人認(rèn)為拍擊板子會讓刺激物在孔中混合均勻，實(shí)際上，通過擴(kuò)散，刺激物也會很快混合均勻。拍擊板子會讓細(xì)胞成圈的分布在孔的外周。

⑨當(dāng)加完所有的樣品之后，蓋上板蓋，放入二氧化碳培養(yǎng)箱，37°C培養(yǎng)18-24小時(shí)。 注意在整個(gè)培養(yǎng)過

程中避免移動、碰撞培養(yǎng)板。為了取得更好的結(jié)果，甚至開關(guān)培養(yǎng)箱的箱[ ]也應(yīng)該禁止。因?yàn)榕鲎矔斐杉?xì)胞的移位，造成斑點(diǎn)的模糊、拖尾。

(3)第三天:培養(yǎng)后操作

①傾倒孔內(nèi)的細(xì)胞及培養(yǎng)基。

②低滲法將細(xì)胞裂解，每孔加入200μL冰冷的去離子水，將板置于冰上冰浴10分鐘。

③每孔用200μLPBST洗滌10遍，洗滌后- 遍之后,將板倒扣在吸水紙上拍干。

④按照試劑盒說明的濃度，用抗體稀釋液稀釋檢測抗體，每孔加入100μL生物素標(biāo)記的檢測抗體,37°C 1小時(shí)。

⑤每孔用200μL PBST洗滌5遍，洗滌后一遍時(shí)， 將PVDF膜板的背面的塑料保護(hù)層取下，同時(shí)洗滌膜的正反兩面，蓋上保護(hù)層，將板倒扣在吸水紙上拍干。

注意:

①洗滌膜的背面，我們摸索出的辦法是，在-個(gè)淺托盤中盛上干凈的PBST,將膜板的底面浸入，輕輕搖晃幾次即可。注意，-定要將膜的背面和塑料保護(hù)層上的液體甩干之后，再合攏，蓋上，不要傷害到膜。

②按照試劑盒說明的濃度，用抗體稀釋液稀釋酶標(biāo)的鏈霉親和素，每孔加入100L, 37°C 1小時(shí)。

③每孔用200μL PBST洗滌5遍， 洗滌后-遍時(shí)，將PVDF膜板的背面的塑料保護(hù)層取下，同時(shí)洗滌膜的正反兩面，蓋上保護(hù)層，將板倒扣在吸水紙上拍干。

④照試劑盒的說明，解凍已配好的AEC顯色液。每孔加入100μL的顯色液，室溫靜置20-30分鐘，注意避光。

⑤待斑點(diǎn)生長到適合的大小之后，以去離子水洗滌2遍，終止顯色過程。將板倒扣在吸水紙上,拍干細(xì)小的水珠，之后取下保護(hù)層，放在通風(fēng)的地方，室溫靜置10-30分鐘，讓膜自然晾干。注意不要將板放到烤箱內(nèi)，防止膜發(fā)脆、破裂。

⑥將ELISPPOT板置于Biosys Bioreader4000 PRO自動讀板儀內(nèi),調(diào)節(jié)好合適的參數(shù)，半點(diǎn)計(jì)數(shù),并記錄斑點(diǎn)的各種參數(shù)，作統(tǒng)計(jì)分析。

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