毒理學(xué)，傷口修復(fù)，皮膚癌，對紫外線輻射的反應(yīng)，牛皮癬，濕疹，病毒感染，基因傳遞系統(tǒng)，細(xì)胞分化，化妝品研究/測試

1. 從冰箱中獲取一個(gè)角質(zhì)形成細(xì)胞生長試劑盒; 確保所有組件的蓋子都很緊。
2. 在將生長試劑盒的組分添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基之前解凍它們的組分。必須在37℃水浴中加熱L-谷氨酰胺組分并在加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基之前搖動(dòng)以溶解任何沉淀物。
3. 從冷藏中獲取一瓶真皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基（485mL）。
4. 通過噴灑70％乙醇，對所有生長試劑盒組分小瓶和基礎(chǔ)培養(yǎng)基瓶的外表面進(jìn)行凈化。
5. 使用無菌技術(shù)并在層流罩或生物安全柜中工作，如表1所示，將體積的每個(gè)生長試劑盒組件轉(zhuǎn)移到基礎(chǔ)培養(yǎng)基瓶中，每次轉(zhuǎn)移使用單獨(dú)的無菌移液管。
6. 緊緊蓋住完整生長培養(yǎng)基瓶并輕輕旋轉(zhuǎn)內(nèi)容物以確保均勻溶液。不要用力搖晃以避免起泡。標(biāo)記瓶子和日期。
7. *生長培養(yǎng)基應(yīng)在2°C至8°C的黑暗中儲(chǔ)存（不要冷凍）。在這些條件下儲(chǔ)存時(shí)，完整的生長培養(yǎng)基可穩(wěn)定30天。

   表1.角質(zhì)形成細(xì)胞生長試劑盒組分 

增殖不需要抗微生物劑和酚紅，但如果需要可以加入。表2  總結(jié)了要添加到完整生長培養(yǎng)基中的任一組分（GA溶液或PSA溶液）  的*體積  。

表2.添加抗微生物劑/抗真菌藥和酚紅（可選）

1. 當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到約70％至80％匯合時(shí)，使正常角質(zhì)形成細(xì)胞通過。
2. 在解離前將用于原代細(xì)胞的胰蛋白酶-EDTA（ATCC PCS-999-003）和胰蛋白酶中和溶液（ATCC PCS-999-004）溫?zé)嶂潦覝亍Ｔ谂c細(xì)胞一起使用之前將*生長培養(yǎng)基加熱至37℃。
3. 對于每個(gè)燒瓶，小心地吸出用過的培養(yǎng)基而不打擾單層。
4. 用3至5mL D-PBS（ATCC 30-2200）沖洗細(xì)胞層一次以除去殘留的培養(yǎng)基。
5. 向每個(gè)燒瓶中加入預(yù)熱的胰蛋白酶-EDTA溶液（每25cm 2 1至2mL ）。
6. 輕輕搖動(dòng)每個(gè)燒瓶以確保胰蛋白酶-EDTA溶液*覆蓋細(xì)胞，然后從單層吸出多余的液體。
7. 在顯微鏡下觀察細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞彼此遠(yuǎn)離并向上翻（通常在3到6分鐘內(nèi)）時(shí)，從顯微鏡上取下燒瓶并從幾個(gè)側(cè)面輕輕敲打，以促進(jìn)細(xì)胞從燒瓶表面脫離。
   如果細(xì)胞難以分離，則在37℃下孵育含有細(xì)胞和胰蛋白酶-EDTA溶液的每個(gè)燒瓶以促進(jìn)分散。
8. 當(dāng)大多數(shù)細(xì)胞似乎脫落時(shí)，快速向每個(gè)燒瓶中加入等體積的胰蛋白酶中和溶液（ATCC PCS-999-004）。輕輕移液或旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)物，確保所有胰蛋白酶-EDTA溶液均已中和。
9. 將解離的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到無菌離心管中并放置在一邊，同時(shí)處理培養(yǎng)瓶中的任何剩余細(xì)胞。
10. 向組織培養(yǎng)瓶中加入3至5mL D-PBS（ATCC 30-2200）以收集可能遺留下來的任何其他細(xì)胞。
11. 將細(xì)胞/ D-PBS懸浮液轉(zhuǎn)移到含有胰蛋白酶-EDTA-解離的細(xì)胞的離心管中。
12. 根據(jù)需要重復(fù)步驟10和11，直到從燒瓶中收集所有細(xì)胞。
13. 將細(xì)胞以150×g離心3至5分鐘。
14. 從細(xì)胞沉淀中吸出中和的解離溶液，并將細(xì)胞重懸于2至8mL新鮮的，預(yù)熱的*生長培養(yǎng)基中。
15. 計(jì)數(shù)細(xì)胞，并在每平方厘米2500至5000個(gè)細(xì)胞的密度接種新培養(yǎng)燒瓶2。
16. 將新接種的燒瓶置于37℃，5％CO 2培養(yǎng)箱中至少24至48小時(shí)，然后進(jìn)一步處理細(xì)胞。有關(guān)進(jìn)紙的指導(dǎo)，請參閱維護(hù)。