PCR基因擴(kuò)增儀反應(yīng)條件的選擇
  PCR反應(yīng)一般設(shè)置20~40次循環(huán)，每一循環(huán)包括高溫變性、低溫退火、中溫延伸三步反應(yīng)。每一循環(huán)的產(chǎn)物作為下一個循環(huán)的模板。PCR的擴(kuò)增效率很高，如果循環(huán)次數(shù)是30次，那么新生DN段理論上達(dá)到230拷貝（約為109個分子）。 PCR反應(yīng)每個循環(huán)的三個基本反應(yīng)步驟如下：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA產(chǎn)物解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；③引物的延伸：溫度升到72℃左右，DNA模板－引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復(fù)制鏈。重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需 2～4分鐘，2～3小時就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。到達(dá)平臺期（Plateau）所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。 PCR技術(shù)的特異性取決于引物與模板結(jié)合的特異性。 PCR儀也叫基因擴(kuò)增儀，PCR基因擴(kuò)增儀是利用PCR技術(shù)對特定基因做體外的大量合成，用于以檢測DNA/RNA為目的的各種基因分析。

  溫度參數(shù)：
1、變性：模板變性*與否是PCR成功的關(guān)鍵，一般先于94℃（或95℃）變性3～10min，接著94℃變性30～60s。
2、退火：基因擴(kuò)增儀退火溫度一般低于引物本身變性溫度5℃。引物長度在15～25bp可通過公Tm=(G+C)×4℃+(A+T)×2℃計算退火溫度，一般退火溫度在40～60℃之間，時間為30～45s。如果(G+C)低于50%，退火溫度應(yīng)低于55℃。較高的退火溫度可提高反應(yīng)的特異性。
3、延伸：延伸溫度應(yīng)在Taq酶的適溫度范圍之內(nèi)，一般在70～75℃。延伸時間要根據(jù)DNA聚合酶的延伸速度和目的擴(kuò)增片段的長度確定，通常對于1kb以內(nèi)的片段1min是夠用的。
循環(huán)數(shù)：
PCR的循環(huán)數(shù)主要由模板DNA的量決定，一般20～30次循環(huán)數(shù)較合適，過多的循環(huán)數(shù)會增加非特異擴(kuò)增產(chǎn)物，具體要多少循環(huán)數(shù)可通過預(yù)試驗確定。
PCR產(chǎn)物積累規(guī)律：
反應(yīng)初期產(chǎn)物以2n呈指數(shù)形式增加，至一定的循環(huán)數(shù)后，引物、模板、DNA聚合酶形成一種平衡，產(chǎn)物進(jìn)入一個緩慢增長時期（“停滯效應(yīng)”），即“平臺期”。到達(dá)平臺期所需PCR循環(huán)數(shù)與模板量、PCR擴(kuò)增效率、聚合酶種類、非特異產(chǎn)物竟?fàn)幱嘘P(guān)。