穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株構(gòu)建實驗

  穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株（穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株）指在細(xì)胞中持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)特定基因或干擾特定基因表達(dá)。穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的目的基因質(zhì)粒DNA整合到細(xì)胞染色體上，使細(xì)胞長期穩(wěn)定表達(dá)該基因。

 在基因功能的研究中，基因是否有效轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞，是功能研究的前提條件之一。而穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株則彌補了瞬時感染（或轉(zhuǎn)染）一些功能實驗中由于外源基因表達(dá)時間短的缺陷，便于長期觀察基因?qū)τ诩?xì)胞功能的影響以及蛋白間相互作用。

用轉(zhuǎn)染質(zhì)粒或病毒侵染的方法將構(gòu)建好的含靶基因的載體導(dǎo)入細(xì)胞，根據(jù)不同的基因載體中所含的抗性標(biāo)志選用相應(yīng)的藥物進(jìn)行篩選混合陽性克隆。在陽性混合克隆的基礎(chǔ)上，得到單細(xì)胞長出的陽性單克隆，繼而得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。常用的真核表達(dá)載體的抗性標(biāo)志物有嘌呤霉素（puromycin）、潮霉素（hygromycin）和新霉素（neomycin）。

上海生物有著多年構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的經(jīng)驗，已在H1299、THP-1、MCF7/ADR、A549、V79、MC3T3-E1、CHO、SiHa、3D4/2、HL7702、SW480、HepG2、SGC-7901、MGC-803、HT-29、Saos-2、U-2os、PC12、SK-BR-3、MCF-7、HMSC-ad 、GIST-T1、HEK293、293T等多個種屬細(xì)胞中成功構(gòu)建過表達(dá)和RNAi穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。
   產(chǎn)品特點：
   1、穩(wěn)定：15代以內(nèi)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)。
   2、迅速：一般控制在1個月以內(nèi)完成構(gòu)建。
   3、經(jīng)濟(jì)：價格實惠，性價比高。
   4、質(zhì)量：對外源基因進(jìn)行嚴(yán)格鑒定。

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株構(gòu)建實驗的兩種方法
   1、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后，單克隆方法篩選穩(wěn)定細(xì)胞系。對大多數(shù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較低。對于基因過表達(dá)，如果轉(zhuǎn)染效率達(dá)到40%，基因過表達(dá)尚可。但是對于基因干擾實驗，對轉(zhuǎn)染效率要求遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于基因過表達(dá)，通常質(zhì)粒轉(zhuǎn)染無法滿足。另外，質(zhì)粒游離于細(xì)胞質(zhì)中，很快降解，無法滿足較長時間的檢測項目；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染整合幾率極低，穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建耗時耗力，且得率很低，往往需要挑取單克隆株。

   2、病毒感染篩選穩(wěn)定細(xì)胞株
  病毒感染方法較質(zhì)粒轉(zhuǎn)染篩選單克隆方法更方便和高效，是目前主流的穩(wěn)定細(xì)胞系篩選方法。用慢病毒制備穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，由于其高效整合、高效轉(zhuǎn)錄、高效表達(dá)、宿主范圍廣，感染效率高，且與細(xì)胞染色體整合而不發(fā)生基因重排，是制備穩(wěn)定細(xì)胞株的理想載體。

  穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建服務(wù)流程
   1、載體構(gòu)建：將外源基因構(gòu)建到合適的載體上，如需病毒轉(zhuǎn)染，則包裝病毒。
   2、篩選濃度測定：以 10-14 天細(xì)胞全部死亡的抗生素濃度為篩選濃度。
   3、細(xì)胞接種：轉(zhuǎn)染實驗前天接種細(xì)胞，各種細(xì)胞的平板密度依據(jù)各種細(xì)胞的生長率和細(xì)胞形狀而定。進(jìn)行轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞應(yīng)達(dá)到 60%-80% 覆蓋。
   4、細(xì)胞轉(zhuǎn)染：用構(gòu)建好的載體（或包裝好的病毒）轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞。
   5、抗生素篩選。
   6、鑒定篩選結(jié)果。

   客戶需要提供
   1、構(gòu)建好的外源基因載體或基因模板。
   2、待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系（ 1×106 個細(xì)胞，可傳代，倍增時間小于 48 小時），特殊細(xì)胞需提供培養(yǎng)基。
 
我們提供
   1、構(gòu)建好的外源基因載體。
   2、構(gòu)建好的穩(wěn)定細(xì)胞系。
   3、構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株實驗報告及相關(guān)的外源基因表達(dá)分析。

目前，上海申知心生物科技有限公司，主營實驗技術(shù)服務(wù)、服務(wù)、動物模型構(gòu)建、細(xì)胞株、elisa試劑盒等，歡迎廣大科研愛好者前來咨詢選購！