2024-12-03
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產(chǎn)品說(shuō)明
Trizol PAL 可與 Trizol Reagent（貨號(hào)：R1000）配合使用，可代替氯仿，對(duì)裂解體系進(jìn)行反復(fù)抽提以去除蛋白質(zhì)，用途廣泛，可從動(dòng)物組織、植物材料、各種微生物及培養(yǎng)細(xì)胞等樣品中提取總 RNA。樣品在 Trizol 中被充分裂解的同時(shí)能夠最大限度地保證 RNA 的完整性。在加入 Trizol PAL 離心后，溶液會(huì)分成三層：上層無(wú)色水相、中間層和下層紅色有機(jī)相，RNA 分布在上清層中。收集上清層后，經(jīng)異丙醇沉淀便可以回收得到總 RNA。提取的總 RNA 完整性好，無(wú)蛋白和 DNA污染，可用于各種分子生物學(xué)常規(guī)實(shí)驗(yàn)，如 RT-PCR、Real-time RT-PCR、Northern Blot、Dot Blot、體外翻譯等。
自備試劑
Trizol Reagent（貨號(hào)：R1000）、異丙醇、75%乙醇、無(wú) RNase 的水（新開封或提取 RNA 專用）
注意事項(xiàng)
1、預(yù)防 RNase 污染，應(yīng)注意以下幾方面：
1）使用無(wú) RNase 的塑料制品和槍頭，避免交叉污染。
2）玻璃器皿應(yīng)在使用前于 180℃高溫下干烤 4h，塑料器皿可在 0.5 M NaOH 中浸泡 10 分鐘，用水沖洗后高壓滅菌。
3）配制溶液應(yīng)使用無(wú) RNase 的水。
4）操作人員戴一次性口罩和手套，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要勤換手套。
2、提取的樣品避免反復(fù)凍融，否則影響 RNA 提取得率和質(zhì)量。
3、本使用本制品時(shí)應(yīng)穿戴防護(hù)物品。如果不小心接觸到眼睛，應(yīng)立即用大量的水沖洗并前往醫(yī)院治療。使用時(shí)遠(yuǎn)離火種、熱源。
3、保存在 75%乙醇中的 RNA 沉淀，2-8℃可以保存一周，-20℃條件下可以保存 1 年。
4、RNA 半衰期比較短，容易降解，建議提取后盡快進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，如反轉(zhuǎn)錄成 cDNA， Northern Blot 等。
5、若下游實(shí)驗(yàn)對(duì) DNA 非常敏感，建議用不含 RNase 的 DNase I 對(duì) RNA 進(jìn)行處理。
操作步驟
1、各種材料的處理
1.1 植物組織：取新鮮植物組織在液氮中充分研磨或?qū)⒅参锝M織*碎后直接在 Trizol 中迅速研磨，每 30-50 mg 組織加入 1mL Trizol，混勻。
注：樣品體積一般不要超過(guò) Trizol 體積的 10%。
1.2 動(dòng)物組織：取新鮮或-70℃凍存的動(dòng)物組織盡量剪碎，每 30-50 mg 組織加入 1 mL Trizol，勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。或在液氮中研磨后加入 Trizol 1 mL 混勻。
注：樣品體積一般不要超過(guò) Trizol 體積的 10%。
1.3 單層培養(yǎng)細(xì)胞：吸去培養(yǎng)液，可直接在培養(yǎng)板中加入適量 Trizol（每 10 cm2 面積需要 1 mL Trizol），用取樣器反復(fù)吹打使細(xì)胞裂解。也可用ym處理后，將細(xì)胞溶液轉(zhuǎn)移至 RNase-Free 的離心管中，300×g 離心 5 min，收集細(xì)胞沉淀，仔細(xì)吸除所有上清，加入 Trizol 1 mL 混勻。
注：1）收集細(xì)胞數(shù)量不要超過(guò) 1×10 7。
2）TRNzol 加量根據(jù)培養(yǎng)板面積決定，不是由細(xì)胞數(shù)決定。如果 Trizol 加量不足，可能導(dǎo)致提取的 RNA 中有 DNA 污染。
3）收集細(xì)胞時(shí)一定要將細(xì)胞培養(yǎng)液去除干凈，否則會(huì)導(dǎo)致裂解不充分，造成 RNA 的產(chǎn)量降低。
1.4 細(xì)胞懸液：離心收集細(xì)胞。每 5×10 6-1×10 7動(dòng)物、植物和酵母細(xì)胞或每 10 7細(xì)菌細(xì)胞加入 1 mL Trizol。
注：1）加入 Trizol 前不要洗滌細(xì)胞，以免 RNA 降解。
2）一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞可能需要?jiǎng)驖{儀或液氮研磨處理。
1.5 血液處理：直接取新鮮的血液，加入 3 倍體積 Trizol（推薦 0.25 mL 全血加入 0.75 mL Trizol），充分振蕩混勻。
1.6 可選步驟：對(duì)于蛋白、脂肪、多糖或胞外物質(zhì)含量高的樣品，如肌肉組織、脂肪組織或植物的塊莖，可以在勻漿處理后4℃，12,000 rpm（~13,400×g）離心 10 分鐘以除去不溶物質(zhì)，此時(shí)沉淀中含胞外物質(zhì)、多糖和高分子量的 DNA，而 RNA存在于上清中。
2、樣品中加入 Trizol 后反復(fù)吹打幾次，使樣本充分裂解。室溫放置 5 分鐘，使蛋白核酸復(fù)合物分離。
3、向以上溶液中加入 Trizol Pal，每使用 1 mL Trizol 加入 0.2 mL Trizol Pal，蓋好管蓋，劇烈振蕩 15 秒，室溫放置 2-3分鐘。
4、4℃ 12,000 rpm 離心 15 分鐘，此時(shí)樣品分成三層：紅色有機(jī)相，中間層和上層無(wú)色水相，RNA 主要在水相中，把水相（約 600μL）轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的 RNase-Free 離心管（自備）中。
5、在得到的水相溶液中加入等體積異丙醇，顛倒混勻，室溫放置 10 分鐘。
6、4℃ 12,000 rpm 離心 10 分鐘，棄上清。
7、加入 75%乙醇（用無(wú) RNase 的水配制）洗滌沉淀。每使用 1 mL Trizol 用 1 mL 75%乙醇對(duì)沉淀進(jìn)行洗滌。
8、4℃ 12,000 rpm 離心 3 分鐘，小心吸棄上清，注意不要吸棄 RNA 沉淀。
注：剩余的少量液體可短暫離心，然后用槍頭吸出，注意不要吸棄沉淀。
9、室溫放置 2-3 分鐘，晾干。加入 30-100μL 無(wú) RNase 的水，充分溶解 RNA，得到的 RNA 保存在-70℃，防止降解。
注：沉淀不要過(guò)分干燥，以免難于溶解
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