一項使用pcr檢測法測定馬鈴薯黑脛病菌的標(biāo)準(zhǔn)意見征集中
【化工儀器網(wǎng) 標(biāo)準(zhǔn)】近日，一項由中國檢驗檢疫科學(xué)研究院、上海海關(guān)、廣州海關(guān)技術(shù)中心聯(lián)合起草的《馬鈴薯黑脛病菌檢疫鑒定方法》已經(jīng)編制完成，現(xiàn)正面向社會公開征求意見。
據(jù)了解，為了制定出切實可行的標(biāo)準(zhǔn)，在標(biāo)準(zhǔn)研制之初，標(biāo)準(zhǔn)起草小組就收集和整理了大量有關(guān)馬鈴薯黑脛病菌的文獻(xiàn)資料，包括病菌的分布、寄主、生物學(xué)特性、風(fēng)險分析、檢測方法和新研究進(jìn)展等。實驗室在該病菌正式命名之前就已經(jīng)分離到了菌株，后期又收集到了同屬的其他種菌株，這為此后的分子檢測方法建立以及實際應(yīng)用等信息數(shù)據(jù)為《馬鈴薯黑脛病菌檢疫鑒定方法》的制定奠定了堅實的基礎(chǔ)。
《馬鈴薯黑脛病菌檢疫鑒定方法》是一項適用于進(jìn)出境種球、花卉和種苗等植物繁殖材料中馬鈴薯黑脛病菌的檢疫鑒定以及馬鈴薯黑脛病的田間調(diào)查與監(jiān)測的標(biāo)準(zhǔn)。標(biāo)準(zhǔn)也詳細(xì)規(guī)定了馬鈴薯黑脛病菌的檢測和鑒定方法，其原理是寄主感病后癥狀特點明顯，莖基部和薯塊感染后出現(xiàn)變色和軟腐，可以取樣有癥組織進(jìn)行pcr初檢后分離，或按照細(xì)菌常規(guī)分離方法分離目的菌，隨后根據(jù)被害癥狀、菌落形態(tài)特征、Biolog測試結(jié)果、煙草過敏性反應(yīng)、致病性測試以及分子生物學(xué)檢測等進(jìn)行病菌的分離、檢測和鑒定，需要用到的儀器設(shè)備有超凈工作臺、培養(yǎng)箱、冰箱、高壓滅菌鍋、水浴鍋、離心機(jī)、pcr儀、實時熒光pcr儀、電泳儀、電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)、電子天平、渦旋振蕩器和移液器等。
征求意見稿中還明確規(guī)定了病菌分離的步驟和流程：取癥狀組織病健交界處組織少許，70%酒精表面消毒30s，滅菌水洗3次后轉(zhuǎn)入1mL滅菌水中，浸泡15min，取組織浸出液在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基NA平板上劃線分離，也可將浸出液稀釋10倍、100倍和1000倍后分別取100μL涂布NA平板，28℃下培養(yǎng)2-4d后挑取疑似菌落，純化三次后用于后續(xù)試驗。典型菌落淡黃色，煎蛋狀，中央突起，邊緣不規(guī)則。
此外，標(biāo)準(zhǔn)中采用的常規(guī)PCR檢測方法和實時熒光檢測方法均未正式發(fā)表，但是已經(jīng)在口岸進(jìn)行了6年的測試，包括測試了引進(jìn)的陽性對照菌株和分離鑒定的菌株以及同屬下的所有不同種，均未發(fā)現(xiàn)有假陽性擴(kuò)增，并且對比測試了此前文獻(xiàn)報道的檢測方法，測試結(jié)果顯示文獻(xiàn)報道的引物ds-f/ds-r和探針ds-p可以擴(kuò)增除Dickeya solani以外的其他部分種。
更多詳情請點擊：《馬鈴薯黑脛病菌檢疫鑒定方法》征求意見稿
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